60Co-γ輻射種子處理對‘龍牧806’苜蓿幼苗耐鹽性的影響

李 波，方志堅，李 紅，楊 瞾

(1. 齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾161005)

苜蓿(Medicagosativa)是世界上栽培最多的多年生豆科植物之一，具有高產(chǎn)、營養(yǎng)價值高、適應性廣等特點[1-2]。在國內(nèi)外廣泛種植，是我國土壤鹽堿化地區(qū)研究的重要牧草之一，在改良鹽堿化土壤和促進農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展方面具有潛在的經(jīng)濟價值[3]。土壤鹽漬化是限制牧草產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一，因此，深入研究苜蓿的抗鹽堿能力，擴大苜蓿種植范圍，提高生產(chǎn)力，對促進土壤鹽堿化地區(qū)畜牧業(yè)的經(jīng)濟發(fā)展具有重大意義[4-5]。

60Co-γ輻射誘變育種是一種創(chuàng)造新品種和新種質(zhì)的重要手段[6]，目前誘變育種廣泛應用于多種牧草，通過幼苗生理生化指標的變化來探究輻射對牧草的影響，王月華等[7]發(fā)現(xiàn)50 Gy劑量60Co-γ輻射處理草地早熟禾(Poapratensis)能夠提高超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性；張玉等[8]發(fā)現(xiàn)100～150 Gy劑量能夠提高菊苣(Lactucasativa)幼苗中可溶性糖(Soluble sugar，SS)、可溶性蛋白(Soluble protein，SP)含量和SOD等酶活性，在輻射劑量高于150 Gy時表現(xiàn)為明顯抑制。Qi等[9]發(fā)現(xiàn)，50 Gy劑量的60Co-γ射線可以提高擬南芥(Arabidopsisthaliana)幼苗的耐鹽性并減輕其鹽害程度，同時，高睿等[10]發(fā)現(xiàn)100 Gy劑量60Co-γ射線能顯著提高烏拉爾干草(Glycyrrhizauralensis)種子苗期各生理指標并提高其耐鹽性。處于逆境中的植物會大量積累H2O2和O2-，從而導致膜質(zhì)和蛋白質(zhì)發(fā)生氧化損傷，代謝速率變慢[11]。因此，植物會通過改變抗氧化酶系統(tǒng)來減輕活性氧對細胞膜及胞內(nèi)大分子的損傷，降低逆境對植物造成的傷害[12-13]。60Co-γ射線輻射是一種常見改良作物并提高其抗逆性的一種手段[14]，但利用60Co-γ射線輻照誘變苜蓿對其耐鹽性的研究卻鮮有報道，因此，本研究從60Co-γ輻射對苜蓿耐鹽性影響的角度出發(fā)，探討不同劑量的60Co-γ輻射對苜蓿幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、膜透性物質(zhì)及抗氧化酶活性的影響，以期了解幼苗對輻射的響應，從而為苜?？鼓鏅C制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以黑龍江省畜牧研究所提供的經(jīng)過4種60Co-γ輻射劑量(600 Gy，900 Gy，1 200 Gy，1 500 Gy)的‘龍牧806’苜蓿種子為材料。輻射源由中國農(nóng)業(yè)科學研究院原子能利用研究所提供，輻射劑量依次為600，900，1 200和1 500 Gy，劑量率15 Gy·min-1，每份處理50 g種子，以同一批次相同數(shù)量未經(jīng)處理的種子作為對照。

1.2 方法

1.2.1幼苗的培養(yǎng) 挑選籽粒飽滿的苜蓿種子，采用土培的方法種植在營養(yǎng)缽中(針葉土、營養(yǎng)土和珍珠巖按1∶2∶0.5比例進行混合)，每3 d澆1次水，待苜蓿幼苗生長45 d后，將幼苗從土中取出。

1.2.2NaCl脅迫處理 用清水將各處理組及對照苜蓿幼苗根部清洗干凈，然后將其于1/2 Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)4～5 d。培養(yǎng)完畢后再將其放在質(zhì)量濃度為0.75%的NaCl溶液中處理72 h。每次處理各組長勢均勻的苜蓿幼苗15株，共3次重復，將植株根和葉片分開，置于密封袋中，保存于—80 ℃冰箱中備用，并對苜蓿的葉片及根進行生理生化指標的測定。

1.2.3生理生化指標的測定方法 苜蓿幼苗各生理生化指標的測定方法參照王學奎[15]和高俊鳳等[16]的方法，具體如下：可溶性蛋白(SP)含量測定采用考馬斯亮藍法、脯氨酸(Proline，Pro)含量測定采用酸性茚三酮法、可溶性糖(SS)含量測定采用蒽酮法、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法、相對電導率(Relative conductivity，RC)測定采用浸泡法、過氧化物酶(Peroxidase,POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)活性測定采用比色法。

1.2.4數(shù)據(jù)處理及分析 用Excel 2010軟件進行作圖，用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及相關(guān)分析。

采用隸屬函數(shù)法對不同60Co-γ輻射劑量處理的苜蓿幼苗生理生化指標進行綜合分析，隸屬函數(shù)值計算公式：R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)，反隸屬函數(shù)計算公式：R(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)，式中，Xi為指標測定值，Xmin、Xmax為某項指標的最小值和最大值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同60Co-γ輻射劑量對NaCl脅迫下苜蓿幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

如圖1A所示，苜蓿葉片和根可溶性蛋白(SP)含量隨輻射劑量的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在600 Gy組含量最高，分別為70.45 mg·g-1和32.97 mg·g-1，比對照組增加18.22%和21.60%，輻射劑量為1 200 Gy和1 500 Gy時，葉片中SP含量比對照分別減少6.05%和24.04%；而根中SP含量比對照分別減少27.25%和40.04%，且苜蓿葉片SP含量均高于根。方差分析結(jié)果顯示，輻射組苜蓿葉片的SP含量與對照比較差異均不顯著(P>0.05)，而根的SP含量與對照比較差異均顯著(P<0.05)。600 Gy輻射劑量有利于苜蓿葉片和根SP含量的積累。

如圖1B所示，苜蓿葉片和根脯氨酸(Pro)含量隨輻射劑量的增加呈先升后降的趨勢，600 Gy和900 Gy輻射處理下，葉片中Pro含量為257.30 μg·g-1和233.69 μg·g-1，比對照增加17.33%和6.56%，而根中Pro含量為239.93 μg·g-1和213.87 μg·g-1，比對照增加23.47%和10.06%；當輻射劑量為1 200 Gy和1 500 Gy時，葉片中Pro含量與對照組相比減少21.17%和33.17%，而根中Pro含量較對照組減少31.57%和52.38%，且葉片Pro含量均高于根，與對照組比較差異均顯著(P<0.05)。600 Gy和900 Gy輻射劑量有利于苜蓿葉片和根Pro的積累。

如圖1C所示，苜蓿葉片和根可溶性糖(SS)含量隨著輻射劑量的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，600 Gy組SS含量最高，分別為19.71 mg·g-1和16.71 mg·g-1，比對照增加39.94%和24.53%，而900 Gy，1 200 Gy和1 500 Gy組葉片SS的含量分別比對照減少了17.75%，24.85%和31.66%；根SS的含量分別比對照減少了5.44%，29.35%和44.94%。除根900 Gy組與對照比較差異不顯著外(P>0.05)，其余各輻射組均與對照組比較差異顯著(P<0.05)。600 Gy輻射劑量有利于苜蓿葉片和根SS含量的積累。

圖1 NaCl脅迫下60Co-γ輻射龍牧806苜蓿葉片和根滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化

2.2 不同60Co-γ輻射劑量對NaCl脅迫下苜蓿幼苗膜透性物質(zhì)的影響

如圖2A所示，苜蓿葉片和根丙二醛(MDA)含量隨輻射劑量的增加呈現(xiàn)上升趨勢，對照組MDA含量最低，分別為22.98 μmol·g-1和14.03 μmol·g-1，600～1 500 Gy組葉片MDA含量分別比對照增加19.23%，39.17%，60.72%，109.17%；而根MDA含量分別比對照增加23.69%，66.93%，91.07%，175.99%；高劑量(1 200 Gy和1 500 Gy)組的MDA含量與對照組相比差異顯著(P<0.05)。輻射處理導致苜蓿葉片和根部細胞膜的損傷，使各輻射組葉片和根的MDA含量均高于對照組。

如圖2B所示，苜蓿葉片和根相對電導率(RC)隨輻射劑量的增加呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，對照組RC最低，為55.54%和43.15%，1 500 Gy組RC最高，分別為89.09%和86.97%。在經(jīng)過不同劑量的60Co-γ輻照處理后，葉片RC分別比對照增加21.52%，35.43%，52.64 %和60.41 %，而根RC分別比對照增加39.01%，67.61%，80.45%和101.55%，且與對照比較差異均顯著(P<0.05)。

圖2 NaCl脅迫下60Co-γ輻射龍牧806苜蓿葉片和根膜透性物質(zhì)的變化

2.3 不同60Co-γ輻射劑量對NaCl脅迫下苜蓿幼苗抗氧化酶活性的影響

如圖3A所示，苜蓿葉片和根過氧化物酶(POD)活性均隨輻射劑量的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，600 Gy組的葉片和根POD活性最高，為19 966.67 U·g-1FW·min-1和24 333.33 U·g-1FW·min-1，比對照組增加20.77%和32.97%，且與對照相比差異顯著(P<0.05)，1 200 Gy和1 500 Gy組的葉片和根POD活性分別比對照減少35.69%和45.77%，而根POD活性分別比對照減少10.20%和39.16%。600 Gy和900 Gy劑量處理促進苜蓿葉片和根POD活性的增加。

如圖3B所示，苜蓿葉片和根的多酚氧化酶(PPO)活性均隨輻射劑量的增加呈先升后降的趨勢，600 Gy組PPO活性最高，為1 686.67 U·g-1FW·min-1和2 523.33 U·g-1FW·min-1，與對照組的PPO活性相比增加108.23%和159.25%，葉片 900 Gy,1 200 Gy和1 500 Gy的酶活分別比對照增加43.62%,29.63%和11.52%，僅600 Gy輻射組葉片的PPO活性與對照相比差異顯著(P<0.05)，根部900 Gy和1 200 Gy組PPO活性比對照高出144.52%和58.22%，且與對照組相比差異顯著(P<0.05)，僅1 500 Gy組的酶活比對照降低8.90%。600 Gy，900 Gy和1 200 Gy組根的PPO活性與對照相比差異顯著(P<0.05)，600～1 200 Gy輻射劑量可促進苜蓿的葉片和根PPO活性增加。

圖3 NaCl脅迫下60Co-γ輻射龍牧806苜蓿葉片和根兩種抗氧化酶的變化

2.3 苜蓿幼苗葉片和根系各生理生化指標相關(guān)性分析

表1對鹽脅迫下各測定指標之間做相關(guān)性分析，可以看出各指標間的相關(guān)程度各不相同。葉中Pro與SP和POD、POD與SP、PPO與MDA之間均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.969，0.965，0.997和0.967，MDA與RC呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.937。根中POD與SP，SS與Pro均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.997和0.965，SS與SP和POD呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.938和0.930，MDA與RC呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.927，其它各指標間均存在一定程度的正相關(guān)或負相關(guān)。

表1 各指標相關(guān)系數(shù)矩陣

注：*代表在0.05水平上顯著相關(guān)，**代表在0.01水平上顯著相關(guān)

Note:* represents significant correlation at the 0.05 level,and **represents significant correlation at the 0.01 level

2.4 苜蓿幼苗葉和根各生理生化指標隸屬函數(shù)分析

應用隸屬法對NaCl脅迫下不同輻射處理的苜蓿種子的幼苗葉片和根生理生化指標進行綜合分析得出(表2)，苜蓿幼苗葉片和根對NaCl抗性由強到弱依次為：600 Gy>0 Gy>900 Gy>1 200 Gy>1 500 Gy。隸屬函數(shù)綜合評價值越大，表明對苜蓿幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累越多、抗氧化酶活性越高及對膜損傷越小。依據(jù)輻射苜蓿種子的幼苗葉片和根生理生化的變化可知600 Gy輻射劑量可以提高苜蓿對NaCl的抗性。

表2 葉和根各指標隸屬函數(shù)值

3 討論

植物苗期是對鹽脅迫做出反應的敏感時期，植物各項生理生化指標的變化可以直接反映鹽害程度。鹽脅迫下，植物會出現(xiàn)鹽害癥狀，鹽害主要為離子毒害以及滲透脅迫[17-19]。為了維持植物自身正常的生理代謝，植物會通過滲透調(diào)節(jié)方式來降低鹽害的影響[20]。通過測定SS,SP,Pro等植物滲透調(diào)節(jié)的指標來反映植物的抗鹽能力。

本試驗研究結(jié)果表明，不同劑量60Co-γ射線輻射，對NaCl脅迫下的苜蓿幼苗的SP，SS，Pro的影響作用不同。植物體內(nèi)SS，SP和Pro的含量與植物的抗逆性有關(guān)，逆境環(huán)境下，植物自身會主動積累這些物質(zhì)以適應外界環(huán)境的變化，對植物起著保護作用，達到自我修復的效果[21]。此外，SS和SP是生物體的重要組成部分，在植物的發(fā)育與代謝中具有重要作用[22]。鹽脅迫環(huán)境下，植物體內(nèi)SS和Pro會大量積累，以減少逆境環(huán)境對植物自身造成的傷害。隨著輻射劑量的增加，各生理指標均呈先上升再下降的變化趨勢，其中SP和Pro含量在劑量600 Gy和900 Gy時高于對照組，說明低輻射劑量下苜蓿幼苗能進行自我修復，提高其對輻射的損傷，但隨輻射劑量的增加，修復效果減弱，該結(jié)果與滕娟等[23]研究60Co-γ輻射對三七(Panaxnotoginseng)幼苗特性影響的結(jié)果一致。低劑量的輻射處理下，苜蓿幼苗中的脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量明顯高于對照組，這說明輻射處理可以在一定程度上提高苜蓿幼苗的滲透調(diào)節(jié)能力，從而提高植物的耐鹽性。MDA是膜脂過氧化產(chǎn)物，可以反映植物膜質(zhì)氧化度及植物遭受逆境傷害的程度，其含量越高膜脂過氧化程度越大[24]。植物細胞膜具有選擇透性，逆境脅迫時，細胞膜受損導致電解質(zhì)外滲，因此當植物受傷害愈嚴重，外滲出的物質(zhì)就會變多導致介質(zhì)導電性也變強，最終電導率就會升高，測得相對電導率的高低代表膜的透性強弱。本研究表明隨著輻射劑量的升高MDA和RC均呈上升的趨勢，細胞膜損傷加重，破壞膜系統(tǒng)的完整性，李瑜等[25]研究60Co-γ輻射對桂花(Osmanthusfragrans)生理指標影響也得到了相似結(jié)論，這說明，低劑量的輻射雖然可以一定程度上提高植物的耐鹽性，但輻射還是會引起苜蓿幼苗細胞膜脂的過氧化作用，以及在一定程度上破壞脂膜透性，并且隨著劑量的增加，膜脂過氧化作用加劇。

在NaCl脅迫下，為適應鹽脅迫條件對苜蓿的影響，苜蓿體內(nèi)抗氧化酶POD、PPO等可緩解因逆境對植物造成的傷害，這些抗氧化酶的活性可以反映植物自身清除活性氧的能力，也代表植物抗逆性的強弱[26]。POD是植物生命代謝中重要的抗氧化酶，參與清除由逆境植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧，減少植物細胞受到損害，本試驗中，輻射劑量為600 Gy時，POD活性達到最大，說明在此劑量下POD清除細胞內(nèi)活性氧的能力最強，從而緩解了鹽脅迫對苜蓿的活性氧氧化損傷作用，輻射劑量繼續(xù)增加，活性氧清除能力減弱，氧代謝平衡失調(diào)，導致酶活性下降[27]。PPO也是植物中常見的一種酶，在植物完好時PPO無活性，但是當植物受到損傷時便表現(xiàn)出活性，本試驗在鹽脅迫條件下苜蓿受到了鹽害，導致PPO活性增強，由于根部與鹽環(huán)境直接接觸，從而導致苜蓿根部的POD，PPO的活性要大于葉片的POD和PPO活性，這說明苜蓿根部對輻射的敏感性在一定程度上要大于其葉片的敏感性[28]。通過對苜蓿幼苗各指標進行隸屬函數(shù)的綜合分析，可以發(fā)現(xiàn)低輻射劑量(600 Gy)有利于提高苜蓿的耐鹽性。

4 結(jié)論

60Co-γ射線對鹽脅迫下的‘龍牧806’苜蓿幼苗生理生化指標的影響較明顯，即低輻射劑量(600 Gy)能夠促進SS等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，減少膜損傷，同時，抗氧化酶活性升高，活性氧清除能力增強，保持活性氧代謝平衡。隨著輻射劑量的增加，膜系統(tǒng)完整性遭到破壞，電解質(zhì)外滲導致MDA含量和RC上升。相關(guān)性分析結(jié)果表明，葉中Pro與SP和POD、POD與SP、PPO與MDA之間均呈極顯著正相關(guān)，根中POD與SP，SS與Pro均呈極顯著正相關(guān)。隸屬函數(shù)綜合分析可知，600 Gy是‘龍牧806’苜蓿誘變育種較合適劑量。