兩株嗜鹽古菌所產(chǎn)C50類胡蘿卜素的鑒定及抗氧化活性

侯 靖 呂 布 崔恒林

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 江蘇鎮(zhèn)江 212013）

類胡蘿卜素是一類應(yīng)用廣泛的黃色、橙紅色或紅色的脂溶性萜烯類色素，普遍存在于細(xì)菌、古菌、藻類、真菌和植物中[1]。迄今，被發(fā)現(xiàn)的天然類胡蘿卜素已達(dá)750多種，其中大部分為由8個類異戊二烯單位組成的C40類胡蘿卜素[1]。人類和大部分動物自身不能合成類胡蘿卜素，必須從食物中獲取。類胡蘿卜素的長多烯碳鏈?zhǔn)蛊渚哂锌寡趸饔?，能夠保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，具有防癌、抗衰老、預(yù)防心血管疾病等生物活性功能[2]。作為著色劑和功能成分，類胡蘿卜素已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域。采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然類胡蘿卜素不僅避免了化學(xué)合成法存在的安全性問題，而且克服了植物提取法受原料和季節(jié)限制的缺點，因而，微生物成為天然類胡蘿卜素的主要來源[3-4]。

嗜鹽古菌是一類通常生活在海水曬鹽場、鹽湖、腌制食品等高鹽環(huán)境中的好氧或兼性厭氧、化能異養(yǎng)型原核微生物，在發(fā)酵工業(yè)中具有廣泛應(yīng)用前景[5]。大部分嗜鹽古菌能夠合成類胡蘿卜素，呈現(xiàn)橙色或紅色菌落。值得一提的是，很多嗜鹽古菌合成的是C50類胡蘿卜素，并非自然界常見的C40類胡蘿卜素[6]。雖然嗜鹽古菌合成類胡蘿卜素早在20世紀(jì)60年代就有報道[7]，然而，相比于其它生物，對嗜鹽古菌類胡蘿卜素的研究卻相對較少[8]，尤其是從未有過分離純化嗜鹽古菌類胡蘿卜素粗提物的主要組分，并研究其生物活性的報道。嗜鹽古菌成為有待進(jìn)一步開發(fā)的產(chǎn)類胡蘿卜素微生物資源。本研究以本實驗室從美國猶他州大鹽湖分離的解脂鹽紅菌（Halorubrum lipolyticum GSL-59）和我國浙江舟山鹽田分離的海濱鹽水紅菌（Salinarubrum litoreum ZS-1-H）為研究對象，純化并鑒定其類胡蘿卜素主要組分，探究其抗氧化活性，為開發(fā)應(yīng)用嗜鹽古菌類胡蘿卜素資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

解脂鹽紅菌GSL-59，本實驗室分離保藏；海濱鹽水紅菌ZS-1-H，編號CGMCC 1.12544，本實驗室分離，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心；地中海富鹽菌（Haloferax mediterranei ATCC 33500），中國普通微生物菌種保藏管理中心。

硅膠薄層層析板，德國默克公司；普通層析柱（內(nèi)徑15 mm，長度350 mm），泰興市三愛思實驗儀器廠；β-胡蘿卜素，美國Sigma公司；酵母提取物、魚蛋白胨，oxoid試劑公司；其它試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純級。

NHM 培養(yǎng)基成分（g/L）：酵母提取物 0.05，魚蛋白胨 0.25，丙酮酸鈉 1.0，KCl 5.4，CaCl20.29，NH4Cl 0.27，MgSO4·7H2O 26.8，MgCl2·6H2O 23.0，NaCl 184.0，K2HPO40.3，pH 7.0～7.2。

1.2 設(shè)備與儀器

超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；全自動滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司；HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；Avanti J-14離心機(jī)，Beckman公司；HYG-C型多功能搖床，太倉實驗設(shè)備廠；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；pHS-3TC型酸度計，上海天達(dá)儀器有限公司；B040234全自動酶標(biāo)儀，芬蘭Thermo公司；DU800TM核酸蛋白分析儀，Beckman-Coulter公司；LXQ型液相色譜離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，Thermo公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 類胡蘿卜素的提取和定量 參考Fang等[9]的方法于暗處提取類胡蘿卜素。解脂鹽紅菌、海濱鹽水紅菌和地中海富鹽菌經(jīng)NHM液體培養(yǎng)基活化后，以2%的比例接種于500 mL NHM培養(yǎng)基中，37℃，130 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期。將菌液于4℃，10 000×g離心15 min，收集菌體，用滅菌的10%NaCl溶液懸洗3遍后，加入50 mL丙酮于搖床振蕩提取 30 min。4℃，10 000×g離心 15 min，收集上清液，殘渣繼續(xù)用丙酮提取至顏色灰白。合并上清，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用少許甲醇溶解殘留物，于-20℃避光保存。

1.3.2 類胡蘿卜素的紫外-可見吸收光譜（UVVis）分析對類胡蘿卜素溶液在350～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描，記錄吸收光譜。

1.3.3 類胡蘿卜素的薄層層析（TLC）分析 將3株嗜鹽古菌的類胡蘿卜素溶液點樣于TLC板，晾干后將TLC板置于盛有展開劑為丙酮∶正庚烷=50∶50（V∶V）的層析缸內(nèi)展開[9]。待展開劑前沿離頂端約0.5 cm時，取出TLC板，晾干，掃描、拍照。

1.3.4 硅膠柱層析法純化類胡蘿卜素粗提物 稱取10 g硅膠（120℃，活化2 h）溶解于正庚烷/丙酮（80∶20，V∶V）中，濕法裝柱。將類胡蘿卜素粗提物上樣，用正庚烷/丙酮混合溶劑梯度逐級洗脫，經(jīng)70∶30，60∶40，50∶50（V∶V）比例的正庚烷/丙酮分別洗脫各紅色條帶。收集的洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后，用少量甲醇溶解。

1.3.5 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）分析色譜條件：Shim-pack VP-ODS C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），檢測波長 493 nm，流速 0.9 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30℃。流動相：A：100%甲醇；B：100%異丙醇。 洗脫條件：0～5 min，100% ～98% A；5 ～35 min，98% ～95% A；35 ～40 min，100%A。

質(zhì)譜條件：大氣壓力化學(xué)電離源（APCI），掃描范圍m/z 100～1200，正離子監(jiān)測模式；蒸發(fā)溫度400℃，透鏡電壓120 V，毛細(xì)管電壓40 V，毛細(xì)管溫度250℃。

1.3.6 DPPH自由基清除能力的測定 利用酶標(biāo)儀測定DPPH自由基的清除率。將40 μL類胡蘿卜素溶液（4.0 μg/mL，8.0 μg/mL，12.0 μg/mL）和140 μL 0.5 mmol/L DPPH溶液（甲醇配制）混勻，于暗處靜置30 min，測量反應(yīng)液在517 nm處的吸光度 Ai。同時測量 Ac：140 μL 0.5 mmol/L DPPH溶液和40 μL 甲醇的混合液的吸光度，Aj：40 μL類胡蘿卜素溶液和140 μL甲醇的混合液的吸光度。 清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]× 100%。 設(shè)置 3組平行試驗。

1.3.7 羥基自由基清除能力的測定 采用酶標(biāo)儀測定羥基自由基的清除率。將50 μL 4 mmol/L FeSO4溶液，50 μL 4 mmol/L H2O2溶液和50 μL類胡蘿卜素溶液（4.0 μg/mL，8.0 μg/mL，12.0 μg/mL）混勻，靜置 10 min，加入 50 μL 4 mmol/L 水楊酸溶液（乙醇配制），混勻，靜置30 min后于510 nm處測量吸光值A(chǔ)i。同時測量Ac：甲醇代替類胡蘿卜素溶液的吸光度；Aj：乙醇代替水楊酸溶液的吸光度。清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]× 100%。設(shè)置3組平行試驗。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)測定3次，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS 18.0進(jìn)行顯著性分析，顯著水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 類胡蘿卜素粗提物的UV-Vis分析

如圖1所示，解脂鹽紅菌的類胡蘿卜素粗提物在464，494 nm和525 nm處有明顯的吸收峰，海濱鹽水紅菌的類胡蘿卜素粗提物在465，493 nm和524 nm處有明顯的吸收峰。另外，在約367 nm和384 nm處均有兩個順式異構(gòu)體吸收峰。兩株嗜鹽古菌類胡蘿卜素的紫外-可見吸收光譜呈現(xiàn)C50類胡蘿卜素菌紅素及其衍生物特有的三指峰光譜[10]，提示其主要組分為菌紅素及其衍生物。

圖1 兩株嗜鹽古菌類胡蘿卜素粗提物的UV-vis光譜Fig.1 UV-vis absorption spectra of the carotenoids from two haloarchaeal strains

2.2 類胡蘿卜素粗提物的TLC分析

以地中海富鹽菌的類胡蘿卜素粗提物作為TLC分析的參照樣，其3個紅色條帶已被確定為菌紅素、單脫水菌紅素和雙脫水菌紅素[9]。從圖2可看出，解脂鹽紅菌和海濱鹽水紅菌的類胡蘿卜素粗提物在對應(yīng)的位置同樣存在3個紅色條帶，表明解脂鹽紅菌和海濱鹽水紅菌中可能也存在菌紅素、單脫水菌紅素和雙脫水菌紅素，并且菌紅素是最主要組分。

圖2 解脂鹽紅菌（1）、海濱鹽水紅菌（2）、地中海富鹽菌（3）類胡蘿卜素粗提物的TLC圖譜Fig.2 TLC analysis of the carotenoids from Hrr.lipolyticum（1），Srr.litoreum（2）and Hfx.mediterranei（3）

2.3 解脂鹽紅菌類胡蘿卜素主要組分的鑒定及含量分析

解脂鹽紅菌類胡蘿卜素粗提物經(jīng)硅膠柱層析純化，獲得3個紅色組分R1、R2和R3。如圖3和表1所示，R1組分的HPLC圖譜上主要有4個峰，質(zhì)譜結(jié)果表明其相對分子質(zhì)量為740，推斷為菌紅素。R2組分的HPLC圖譜上主要有5個峰，除峰2外，其它4個峰的相對分子質(zhì)量為722，推斷為單脫水菌紅素。峰2需在后續(xù)研究中進(jìn)一步鑒定。R3組分的HPLC圖譜上主要有3個峰，其相對分子質(zhì)量為704，推斷為雙脫水菌紅素。碎片離子符合已報道的菌紅素、單脫水菌紅素和雙脫水菌紅素的斷裂模式[11]，如丟失水分子（-18）、C4H10（-58）和C8H10（-106）等。 每個組分中不同保留時間的峰可能是不同的順、反異構(gòu)體[11]。R1、R2和R3分別為菌紅素、單脫水菌紅素和雙脫水菌紅素。如圖3和表2所示，根據(jù)相近保留時間，推斷粗提物的HPLC圖譜上峰1～4為菌紅素，峰5～7為單脫水菌紅素，峰8～10為雙脫水菌紅素。基于峰面積比，可得解脂鹽紅菌類胡蘿卜素中菌紅素含量為84.91%，單脫水菌紅素含量為7.87%，雙脫水菌紅素含量為4.03%。

圖3 解脂鹽紅菌類胡蘿卜素主要組分及粗提物的HPLC圖譜Fig.3 HPLC elution profiles of the purified carotenoid components and crude carotenoid extract from Hrr.lipolyticum

表1 解脂鹽紅菌類胡蘿卜素主要組分的HPLC-MS/MS分析Table1 HPLC-MS/MS analysis of the purified carotenoid components from Hrr.lipolyticum

表2 解脂鹽紅菌類胡蘿卜素主要組分的含量分析Table2 Content of the purified carotenoid components from Hrr.lipolyticum

圖4 海濱鹽水紅菌類胡蘿卜素主要組分及粗提物的HPLC圖譜Fig.4 HPLC elution profiles of the purified carotenoid components and crude carotenoid extract from Srr.litoreum

2.4 海濱鹽水紅菌類胡蘿卜素主要組分的鑒定及含量分析

海濱鹽水紅菌類胡蘿卜素粗提物經(jīng)硅膠柱層析純化，得到2個紅色組分R1和R2。如圖4和表3所示，R1組分的HPLC圖譜上主要有4個峰，其相對分子質(zhì)量為740，推斷為菌紅素。R2組分的HPLC圖譜上主要有5個峰，除峰2外，其它4個峰的相對分子質(zhì)量為722，推斷為單脫水菌紅素。峰2需在后續(xù)研究中進(jìn)一步鑒定。碎片離子符合已報道的菌紅素和單脫水菌紅素的斷裂模式，每個組分中不同保留時間的峰可能是不同的順、反異構(gòu)體[11]。R1和R2分別為菌紅素和單脫水菌紅素。同樣地，如圖4和表4所示，根據(jù)相近保留時間，推斷粗提物的HPLC圖譜上峰1～4為菌紅素，峰5～7為單脫水菌紅素?；诜迕娣e比，可得海濱鹽水紅菌類胡蘿卜素中菌紅素含量為94.86%，單脫水菌紅素含量為1.17%。雙脫水菌紅素可能由于含量很低，因此未純化得到。

2.5 DPPH自由基清除能力

從解脂鹽紅菌類胡蘿卜素粗提物中純化得到各組分的DPPH自由基清除能力如圖5所示。菌紅素、單脫水菌紅素和雙脫水菌紅素組分的DPPH自由基清除能力雖無顯著差異（P＞0.05），但均顯著高于β-胡蘿卜素（P＜0.05）。從海濱鹽水紅菌類胡蘿卜素粗提物中純化得到的各組分的DPPH自由基清除能力如圖6所示。同樣，菌紅素和單脫水菌紅素組分的DPPH自由基清除能力雖無顯著差異（P＞0.05），但均顯著高于β-胡蘿卜素（P＜0.05）。DPPH自由基清除能力均呈濃度依賴性，隨著濃度升高，清除能力明顯增強(qiáng)。

2.6 羥基自由基清除能力

從解脂鹽紅菌類胡蘿卜素粗提物中純化得到的各組分的羥基自由基清除能力如圖7所示。菌紅素、單脫水菌紅素和雙脫水菌紅素組分的羥基自由基清除能力雖無顯著差異（P＞0.05），但均顯著高于β-胡蘿卜素（P＜0.05）。從海濱鹽水紅菌類胡蘿卜素粗提物中純化得到的各組分的羥基自由基清除能力如圖8所示。菌紅素和單脫水菌紅素組分的羥基自由基清除能力雖無顯著差異（P＞0.05），但均顯著高于 β-胡蘿卜素（P＜0.05）。羥基自由基清除能力均呈濃度依賴性，隨著濃度升高，清除能力明顯增強(qiáng)。

表3 海濱鹽水紅菌類胡蘿卜素主要組分的HPLC-MS/MS分析Table3 HPLC-MS/MS analysis of the purified carotenoid components from Srr.litoreum

表4 海濱鹽水紅菌類胡蘿卜素主要組分的含量分析Table4 Content of the purified carotenoid components from Srr.litoreum

圖5 解脂鹽紅菌類胡蘿卜素各組分DPPH自由基清除能力Fig.5 DPPH radical scavenging activities of the purified carotenoid components from Hrr.lipolyticum

圖6 海濱鹽水紅菌類胡蘿卜素各組分DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging activities of the purified carotenoid components from Srr.litoreum

圖7 解脂鹽紅菌類胡蘿卜素各組分羥基自由基清除能力Fig.7 Hydroxyl radical scavenging activities of the purified carotenoid components from Hrr.lipolyticum

圖8 海濱鹽水紅菌類胡蘿卜素各組分羥基自由基清除能力Fig.8 Hydroxyl radical scavenging activities of the purified carotenoid components from Srr.litoreum

解脂鹽紅菌3個純化的組分在檢測濃度范圍內(nèi)DPPH自由基清除率在23%～40%，羥基自由基清除率24%～44%；海濱鹽水紅菌兩個純化的組分在檢測濃度范圍內(nèi)DPPH自由基清除率在18%～31%，羥基自由基清除率約28%～52%。兩個菌株純化的組分清除DPPH和羥基自由基的能力存在一定差異，可能是因存在不同比例的順、反式異構(gòu)體?？偟膩碚f，菌紅素、單脫水菌紅素或雙脫水菌紅素組分的自由基清除能力均顯著高于β-胡蘿卜素，提示較高的抗氧化活性，這可能是由于類胡蘿卜素抗氧化活性與其分子中含有的共軛雙鍵的數(shù)目有密切的關(guān)系[12]。菌紅素、單脫水菌紅素和雙脫水菌紅素存在13個共軛雙鍵，而β-胡蘿卜素僅有11個共軛雙鍵，因而，C50類胡蘿卜素菌紅素及其衍生物在抗氧化活性方面具有重要的應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

1）采用紫外-可見光譜法、薄層層析和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對兩株嗜鹽古菌所產(chǎn)類胡蘿卜素進(jìn)行組分鑒定及含量分析，結(jié)果表明：解脂鹽紅菌的類胡蘿卜素中菌紅素占84.91%，單脫水菌紅素7.87%，雙脫水菌紅素4.03%；海濱鹽水紅菌的類胡蘿卜素中菌紅素占94.86%，單脫水菌紅素1.17%。

2）通過硅膠柱層析純化類胡蘿卜素粗提物中的主要組分，通過測定DPPH和羥基自由基清除能力評價其抗氧化活性，結(jié)果表明：解脂鹽紅菌和海濱鹽水紅菌的菌紅素、單脫水菌紅素或雙脫水菌紅素組分的DPPH和羥基自由基清除能力均呈濃度依賴性，并且均顯著高于β-胡蘿卜素，提示具有較強(qiáng)的抗氧化活性。