李思巧，韋 伊，劉洪妤，張志東，張 野，王麗華，劉玉林

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌712100；2.四川省林業(yè)科學(xué)研究院 生物技術(shù)與良種研究所，四川 成都 610081）

簡單序列重復(fù)（SSR）廣泛分布于真核生物的核基因組，葉綠體基因組以及線粒體基因組中，常指一類以1～6個核苷酸為重復(fù)基元的串聯(lián)重復(fù)DNA序列［1］。因其分布廣泛、多態(tài)性高且具共顯性，SSR標(biāo)記被廣泛開發(fā)和應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定與遺傳多樣性分析［2-3］。在植物中，由于葉綠體基因組表現(xiàn)為母系遺傳，以半保留方式進(jìn)行自我復(fù)制，幾乎不發(fā)生重組，保守性遠(yuǎn)高于核基因組。因此，葉綠體基因組中的SSR標(biāo)記（chloroplast SSR，cpSSR）可在更高分類水平上進(jìn)行種間、種內(nèi)鑒定和遺傳進(jìn)化分析［4］。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，大量植物的葉綠體基因組被測序與公布，相應(yīng)的葉綠體SSR也得到了廣泛的開發(fā)與應(yīng)用［5-7］?；ń穁anthoxylum bungeanum是蕓香科Rutaceae花椒屬Zanthoxylum植物，其果皮曬干后是中國傳統(tǒng)的調(diào)味料和中草藥。在市場上流通的花椒果皮主要來自于花椒Z.bungeanum（又稱紅花椒或大紅袍花椒）和竹葉花椒Z.armatum（又稱青花椒），而在日本主要利用日本花椒Z.piperitum（又稱胡椒木或朝倉花椒）進(jìn)行麻味物質(zhì)和其他藥用活性成分的提取分析［8］。在前人的研究中，基于核基因組內(nèi)部序列差異開發(fā)的 SCAR（sequence-related amplified polymorphism）標(biāo)記［9］、 ISSR（inter-SSR）標(biāo)記［10］和 ESTSSR（expressed sequence tags-SSR）標(biāo)記［11］等已利用到花椒屬植物的遺傳分析中，而cpSSR標(biāo)記在花椒屬植物的開發(fā)與應(yīng)用還未見報道。鑒于此，本研究對花椒cpSSR位點進(jìn)行篩選，分析其分布特點并利用花椒、竹葉花椒和日本花椒種質(zhì)資源開發(fā)多態(tài)性標(biāo)記，以期為花椒屬植物的種質(zhì)資源鑒定、遺傳進(jìn)化分析等提供可靠的標(biāo)記資源。

1 材料與方法

1.1 SSR位點搜索與引物設(shè)計

基于本研究前期獲得的花椒葉綠體基因組序列［12］，利用TRF（tandem repeats finder）在線軟件（http://tandem.bu.edu/trf/trf.html）搜索單核苷酸重復(fù)序列，設(shè)置重復(fù)數(shù)≥10次；利用SSRHunter軟件［13］搜索核苷酸重復(fù)數(shù)位為2，3，4，5的SSR位點，對應(yīng)重復(fù)數(shù)設(shè)置為5，3，3，3次。合并2種軟件的檢測結(jié)果，統(tǒng)計1～5 bp核苷酸重復(fù)所在花椒葉綠體基因組中的位置：長單拷貝序列區(qū)（LSC）、短單拷貝序列區(qū)（SSC）和2個反向重復(fù)序列區(qū)（IR）。SSR引物利用Primer3軟件（http://primer3.ut.ee）設(shè)計。原則為：擴增片段為150～250 bp；引物長度為18～22 bp；退火溫度為57～63℃；GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%～55%。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 種質(zhì)資源采集與DNA提取

本研究共選用16份花椒屬種質(zhì)資源進(jìn)行SSR多態(tài)性的篩選，其中包括來自中國四川省和重慶市的5份竹葉花椒種質(zhì)資源和1份日本花椒種質(zhì)資源（均采自四川省林業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)與良種研究所花椒種質(zhì)圃）以及來自四川、貴州、陜西、山東和山西等5個省的10份花椒種質(zhì)資源（均采自西北農(nóng)林科技大學(xué)鳳縣花椒試驗示范站）進(jìn)行多態(tài)性的篩選（表1）。所有種質(zhì)資源選取3株，取鮮嫩葉片混合，硅膠干燥，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

供試種質(zhì)資源全基因組DNA利用 “植物全基因組DNA提取試劑盒（DP305）”（北京天根生物有限公司）提取，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖結(jié)合紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量和濃度后稀釋至20 mg·L-1，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

PCR擴增體系為20 μL，包括 10 μL 2×TaqMaster Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司），模板DNA（20 mg·L-1）5.0 μL， 正、 反向引物（2 μmol·L-1）各 1.5 μL， 雙蒸水（ddH2O）2.0 μL。 PCR 擴增程序為： 95℃預(yù)變性5 min；然后95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸8 min后4℃保存。取1.5 μL的PCR擴增產(chǎn)物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（恒定功率100 W，100 min）分離檢測，使用pBR322 DNA/MspI Marker作為標(biāo)準(zhǔn)分子量，銀染拍照保存。

表1 供試16份花椒屬種質(zhì)資源來源地Table 1 Origin of 16 germplasms of Zanthoxylum

根據(jù)電泳圖像，統(tǒng)計擴增條帶并構(gòu)建0～1數(shù)據(jù)矩陣，即有共遷移條帶記為1，無條帶則記為0。利用NTSYSpc-2.10軟件計算遺傳相似系數(shù)，采用非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行遺傳相似性聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒葉綠體基因組中SSR的分布特點

花椒葉綠體基因組全長為158401 bp，共搜索出了144個SSR位點（圖1和表2），即在花椒葉綠體基因組中平均每隔1100.00 bp出現(xiàn)1個SSR位點。

根據(jù)SSR位點在花椒葉綠體基因組中的位置（圖1）可知：LSC區(qū)分布85個SSR位點，占SSR總數(shù)的59.03%，平均1010.56 bp出現(xiàn)1個SSR位點；SSC區(qū)分布23個SSR位點，占SSR總數(shù)的15.97%，平均765.65 bp分布1個SSR位點；在 2個 IR區(qū)（IRA和IRB），均分布18個反向重復(fù)的SSR位點，合計占SSR總數(shù)的25.00%，平均1524.72 bp分布1個SSR位點。

圖1 SSR在花椒葉綠體基因組中的分布特點Figure 1 Distribution of SSRs in the chloroplast genome of Zanthoxylum bungeanum

數(shù)量上，單核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)分別有62和70個，兩者占SSR總數(shù)的91.67%，且在LSC區(qū)、SSC區(qū)和IR區(qū)均有分布。二核苷酸重復(fù)和四核苷酸重復(fù)分別只有5個（3.47%）和7個（4.86%），但二核苷酸重復(fù)僅分布于SSC區(qū)，而四核苷酸重復(fù)僅分布于LSC區(qū)。

重復(fù)次數(shù)上，單核苷酸重復(fù)次數(shù)多集中在10～15次，共54個位點，占單核苷酸重復(fù)總數(shù)的87.10%，而重復(fù)數(shù)＞15次的共有8個位點；二核苷酸重復(fù)數(shù)集中在5次，三核苷酸和四核苷酸重復(fù)數(shù)集中在3次。根據(jù)重復(fù)基元類型，單核苷酸重復(fù)中A/T重復(fù)共60個，而C/G重復(fù)位點僅有2個；二核苷酸重復(fù)基元均為AT/TA；AAG/CTT和AAT/ATT為三核苷酸重復(fù)中的優(yōu)勢重復(fù)基元，均為25個，其余重復(fù)基元總計為20個；此外，AAAT為四核苷酸重復(fù)中的優(yōu)勢重復(fù)基元（3個），其余重復(fù)基元總計為4個（表2）。

2.2 多態(tài)性標(biāo)記開發(fā)與通用性分析

根據(jù)SSR位點兩側(cè)序列，由Primer3軟件設(shè)計了30對引物（命名為YLT-01～YLT-30）并合成。其中，YLT-01～YLT-20擴增片段包含的是2個及2個以上的核苷酸重復(fù)位點（YLT-01～YLT-12位于LSC；YLT-14～YLT-18位于SSC區(qū)；YLT-13、19、20位于IR區(qū)），YLT-21～YLT-30擴增片段包含的是單核苷酸重復(fù)位點（YLT-21～YLT-27位于LSC區(qū)；YLT-30位于SSC區(qū)；YLT-28、29位于IR區(qū)）。

表2 花椒cpSSR的重復(fù)類型與次數(shù)Table 2 Repeat types and times of cpSSR in Zanthoxylum bungeanum

經(jīng)PCR擴增篩選，30對引物均能擴增出穩(wěn)定的目的片段。其中，10對引物在供試種質(zhì)中呈現(xiàn)多態(tài)性，占篩選引物總數(shù)的33.33%。如表3所示：10對引物共檢測到24個等位基因。其中，YLT-26包含4個等位基因，YLT-21和YLT-29包含3個等位基因，其余的7個位點（YLT-01，YLT-17，YLT-22，YLT-23，YLT-24，YLT-25和YLT-27）均檢測出2個等位基因。在包含2個等位基因的7個位點中，YLT-01，YLT-17，YLT-24，YLT-25和YLT-27能區(qū)分出日本花椒，花椒與竹葉花椒為一類（擴增片段大小一致），而YLT-22和YLT-23的擴增結(jié)果為：10份花椒種質(zhì)同一帶型，竹葉花椒與日本花椒為同一帶型；YLT-21和YLT-29能將花椒、竹葉花椒和日本花椒區(qū)分開；YLT-26不僅能區(qū)分出花椒、竹葉花椒和日本花椒3個花椒屬的不同種，且能區(qū)分出竹葉花椒種質(zhì)中的狗椒。此外，未檢測到有標(biāo)記在10份花椒種質(zhì)呈現(xiàn)多態(tài)性（圖2）。

在設(shè)計的20對包含2個及2個以上的核苷酸重復(fù)位點的引物中，僅有2對引物表現(xiàn)出多態(tài)性；而包含單核苷酸重復(fù)位點的10對引物中，有8對引物呈現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性比例遠(yuǎn)高于包含多核苷酸重復(fù)的位點。

表3 多態(tài)性SSR引物的基本信息Table 3 Characterizations of polymorphic SSR primers pairs

2.3 聚類分析

基于10個多態(tài)性標(biāo)記的檢測結(jié)果，利用NTSYSpc-2.10軟件對供試的16份花椒屬種質(zhì)進(jìn)行UPGMA聚類分析。如圖2所示：在遺傳相似系數(shù)閾值為0.22時，可將16份花椒種質(zhì)聚為2類，即花椒和竹葉花椒為1類，日本花椒為1類；在遺傳相似系數(shù)閾值為0.59時，可將花椒和竹葉花椒分為2個小類；而在遺傳系數(shù)閾值為0.91時，可將竹葉花椒中的狗椒與其他4種竹葉花椒種質(zhì)區(qū)分為2個小類。聚類結(jié)果與多態(tài)性標(biāo)記的鑒定結(jié)果保持一致。

圖2 16份花椒屬種質(zhì)的UPGMA聚類分析Figure 2 Cluster diagram for 16 germplasms of Zanthoxylum by UPGMA method

3 討論

本研究在花椒的葉綠體基因組中共篩選到144個SSR位點，其中三核苷酸重復(fù)的數(shù)量要高于單核苷酸重復(fù)以及二核苷酸和四核苷酸重復(fù)的數(shù)量，與楊麗等［14］在麻竹Dendrocalamus latiflorus和綠竹Bambusa oldhamii葉綠體基因組中獲得的SSR位點的規(guī)律一致，但與蒺藜苜蓿Medicao truncatula［15］，棉花Gossypium hirsutum［16］和霍山石斛Dendrobium huoshanense［17］等的葉綠體基因組中均以單核苷酸重復(fù)為主不同。原則上，堿基重復(fù)基元越多，越難形成SSR位點。本研究在三核苷酸重復(fù)次數(shù)的篩選上，選擇重復(fù)數(shù)大于或等于3次的位點，而大于3次的重復(fù)位點僅占三核苷酸重復(fù)總數(shù)的11.43%（8個）。因此，本研究的三核苷酸重復(fù)數(shù)量多于單核苷酸重復(fù)是由軟件參數(shù)設(shè)置不同引起。此外，花椒cpSSR在LSC和SSC區(qū)的分布密度要高于IR區(qū)。在花椒葉綠體基因組中，GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)在LSC區(qū)，SSC區(qū)和IR區(qū)中分別為36.87%，33.51%和42.54%［12］。由于GC間有3個氫鍵相連，打破GC鍵所需的能量要高于AT間的2個氫鍵，因此更難造成堿基數(shù)量的增加或減少［18］。由此推斷，花椒葉綠體基因組中IR區(qū)SSR位點相對稀疏的原因與GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)。

葉綠體基因組由于保守性高，不涉及基因重組，因此，其中突變位點也更容易保留，基于葉綠體開發(fā)的SSR標(biāo)記除了保留核基因組SSR標(biāo)記的特點外，其可重復(fù)性也更高，在種質(zhì)資源鑒定中也更具說服力［19］。在本研究獲得的10個多態(tài)性引物中，有2對引物可以把本研究所選花椒屬的3個種區(qū)分開，1對引物可以將竹葉花椒種內(nèi)的 ‘狗椒’區(qū)分出。然而，10對多態(tài)性引物均未在10份花椒種質(zhì)資源中表現(xiàn)出多態(tài)性。由此推斷，相對于竹葉花椒，花椒種內(nèi)的種質(zhì)資源在葉綠體基因組進(jìn)化上保守性更高。

本研究開發(fā)的花椒cpSSR可作為花椒屬種間鑒定的有效標(biāo)記，但要應(yīng)用于種內(nèi)鑒定，需進(jìn)一步篩選種間多態(tài)性更高的cpSSR標(biāo)記或利用EST-SSR、核基因組SSR（Genomic-SSR）等保守性相對較低的標(biāo)記資源進(jìn)行區(qū)分。