仔豬大腸桿菌的分離鑒定及市售藥物比較

趙亮亮

摘 要：采用常規(guī)方法從豬場(chǎng)分離仔豬大腸桿菌，在10份樣中分離出8株致病大腸桿菌。血清型鑒定表明：8株大腸桿菌血清型屬于O138。用K-B法用進(jìn)行10種抗生素耐藥性檢測(cè)。藥物敏感性試驗(yàn)表明，頭孢噻肟CTX，丁胺卡那KAN，呋喃妥因NFT敏感;對(duì)多粘菌素PMB9。0%，對(duì)阿莫西林AMX72。7%，氨芐青霉素AM81。8%，氯霉素C63。6%，氧氟沙星OFX45。4%，環(huán)丙沙星CIP54。5%，青霉素PG90。9%均有不同程度耐藥性。8株中耐藥大腸桿菌最少耐4種抗生素，最多耐7種。對(duì)8種產(chǎn)品藥物進(jìn)行微量肉湯抑菌結(jié)果表明：乙酰甲喹預(yù)溶劑3， 痢菌凈預(yù)混劑抑菌效果好。

關(guān)鍵詞：致病性大腸桿菌 ;血清型鑒定;耐藥試驗(yàn);? 微量肉湯抑菌

一、材料與方法

1.材料

（1）病料采集

用棉拭子蘸取患仔豬黃痢的仔豬肛門(mén)或直腸糞便， 采10份樣。

（2）主要培養(yǎng)基

伊紅美蘭培養(yǎng)基，麥康凱培養(yǎng)基，三糖鐵培養(yǎng)基購(gòu)自浙江微生物試劑有限公司; 普通平板、普通肉湯。

（3）主要試劑和材料

定型血清 大腸桿菌O抗原單價(jià)血清，微生物生物實(shí)驗(yàn)室。蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖等及藥敏片等均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;蛋白胨水溶液、甲基紅試劑、V- P 試劑按盧中華的方法配制。

（4）主要儀器

高倍顯微鏡、 冰箱、電子天平、? 高速臺(tái)式離心機(jī)、搖床。

（5）對(duì)照菌株

實(shí)驗(yàn)所用對(duì)照菌株為大腸桿菌：1515（C83646引起仔豬黃白痢，血清型O149K88）;1496（C83524引起豬水腫病，血清型O78K80），沙門(mén)氏菌cvcc533（血清型C79-13）。

2.8種市售藥物比較

由于細(xì)菌的耐藥譜比較廣，同時(shí)市場(chǎng)上有許質(zhì)量各異的多種藥物，為更好的防控該病，對(duì)市場(chǎng)上的常用8種藥物進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)。

（1）藥物選擇

乙酰甲喹預(yù)溶劑3種，分別代號(hào)為YXJ1，YXJ2，YXJ3;痢菌凈預(yù)溶劑1種， 代號(hào)為L(zhǎng)JJ;痢疾腸炎寧1種， 代號(hào)為L(zhǎng)JC;止痢散1種，代號(hào)為ZLS; 白頭翁散1種，代號(hào)為BTW; 氟哌酸1種，代號(hào)為FPS。

（2）主要試劑和材料

96孔V -型血凝板培養(yǎng)基 麥康凱培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯按使用說(shuō)明配制，杭州微生物試劑有限公司。MH 肉湯， 按100 mL 肉湯， 加1 g 葡萄糖，0。1 mL溴甲酚紫的比例配制稀釋用培養(yǎng)基。

（3）對(duì)照菌株

同上。

3.分離鑒定方法

（1）細(xì)菌分離及染色鏡檢

細(xì)菌分離 將采樣肛門(mén)棉拭子，分別接種麥康凱瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18～24 h，生長(zhǎng)情況、形態(tài)和顏色。并用革蘭氏染色法染色，油鏡檢查。見(jiàn)附一

（2）純化培養(yǎng)

從麥康凱瓊脂平板上挑取單個(gè)磚紅色菌落接種于伊紅美蘭瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18～24 h，然后移植于普通瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

（3）生化試驗(yàn)

①糖發(fā)酵試驗(yàn)。參考獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)的方法進(jìn)行，將各菌株分別接種在蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳酸等糖發(fā)酵生化管中，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，并記錄結(jié)果。

②其它試驗(yàn)。參考獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)的方法進(jìn)行，將各菌株分別做三糖鐵試驗(yàn)，檸檬酸試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V- P試驗(yàn)（IMViC試驗(yàn)），運(yùn)動(dòng)力試驗(yàn)，并記錄結(jié)果。

（4）致病性試驗(yàn)

將上述生化反應(yīng)已鑒定為大腸桿菌的菌株分別接種于普通肉湯，37 ℃培養(yǎng)18 h 后備用。取62只健康小白鼠隨機(jī)分為30組，每組2只，另取2只設(shè)為對(duì)照組;試驗(yàn)組每只小白鼠腹腔接種注射0。2 ml肉湯培養(yǎng)物，對(duì)照組注射無(wú)菌肉湯。兩組隔離飼養(yǎng)觀(guān)察，每8h觀(guān)察小白鼠的情況，并詳細(xì)記錄。

（5）O血清型鑒定

將純化的待檢菌液涂布于普通瓊脂平板上，于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h 后，用適量5 g/ L 石炭酸生理鹽水洗下菌苔，制成濃稠菌懸液;121 ℃高壓2 h ，破壞K 抗原后即為待檢菌的O 抗原;取制備的待檢菌O 抗原及大腸埃希菌O 抗原定型血清各20μL ，在玻板上混勻，30 s 內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象者為陽(yáng)性反應(yīng)。同時(shí)以制備的待檢菌O抗原與石炭酸生理鹽水混合物作對(duì)照，觀(guān)察有無(wú)自凝集現(xiàn)象。

（6）藥敏試驗(yàn)

試驗(yàn)方法嚴(yán)格按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS） 推薦的K-B法進(jìn)行。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取單個(gè)菌落接種于2mL 普通肉湯管內(nèi)，37℃培養(yǎng)16～18h后，用MH 肉湯調(diào)制菌懸液，使其達(dá)到0。5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫然蛴镁溆?jì)數(shù)為108CFU/ml。

4.市售藥物比較--微量肉湯稀釋法

按照藥物使用說(shuō)明將藥物稀釋?zhuān)活?lèi)藥物不同廠(chǎng)家的藥物稀釋到同一濃度。中藥制劑水煎熬制，水浴濃縮到1g/ml。

微量肉湯稀釋法 微量稀釋板的第1～ 12 孔中加入50μLMH 肉湯， 第1孔中加入50μL 一定濃度的藥物。從第1 孔開(kāi)始至第11 孔作倍比稀釋?zhuān)?并從11 孔中棄去50 μL ， 第12 孔做陽(yáng)性對(duì)照。每一孔中加入含108CFU/ml 分離出的大腸桿菌MH 肉湯培養(yǎng)物50 μL， 在第12孔中加入50 μL 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌。振蕩混勻。35℃培養(yǎng)16～ 20 h。用分離大腸桿菌做兩次重復(fù)，用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌1515做對(duì)照。觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。如果有細(xì)菌生長(zhǎng)，則大腸桿菌利用培養(yǎng)基中的葡萄糖，產(chǎn)酸從而使pH降低，指示劑溴甲酚紫顏色發(fā)生改變。培養(yǎng)物為黃色表明有細(xì)菌生長(zhǎng)， 藍(lán)紫色沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)。細(xì)菌生長(zhǎng)完全被抑制的最高稀釋濃度為最小抑菌濃度（M IC）。

二、總結(jié)討論

飼料中添加低劑量的抗生素， 可以有效預(yù)防和控制某些病原菌的感染， 提高畜禽生產(chǎn)性能。據(jù)估計(jì)， 美國(guó)這類(lèi)用途的抗生素占總量40% ， 其中大部分用于養(yǎng)豬生產(chǎn)。由于某些抗生素的長(zhǎng)期和不合理使用，臨床耐藥菌株不斷增加， 耐藥性不斷增強(qiáng)， 給疾病的治療帶來(lái)了嚴(yán)重后果， 也為人類(lèi)健康帶來(lái)了深遠(yuǎn)影響。

由于大腸桿菌易產(chǎn)生耐藥性，臨床用藥時(shí)建議以藥敏試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)。養(yǎng)豬場(chǎng)必須加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生消毒措施，減少大腸埃希菌病的發(fā)生，并應(yīng)定期對(duì)從本場(chǎng)分離的菌株進(jìn)行藥物敏感性監(jiān)測(cè)，在獸醫(yī)指導(dǎo)下選擇敏感性藥物有目的地控制大腸埃希菌病，避免因?yàn)E用藥物造成耐藥菌株產(chǎn)生而導(dǎo)致治療無(wú)效。在藥物治療的同時(shí)，還應(yīng)注意配合補(bǔ)液、收斂等對(duì)癥療法以提高治療效果。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔡寶祥.動(dòng)物傳染病診斷[M].南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，1993：280～288.