馮雨晴，李亞飛，史宏志

河南農業(yè)大學煙草學院/煙草行業(yè)煙草栽培重點實驗室/煙草農業(yè)減害研究中心，鄭州市金水區(qū)文化路95號 450002

白肋煙是一種典型的葉色黃綠突變的煙草類型，其煙葉色素和碳水化合物含量較低，氮同化能力弱，易導致煙葉硝酸鹽含量大量積累，出現(xiàn)氮素利用率低的問題[1-2]。研究表明，相同施氮水平和相同生物量積累條件下，白肋煙煙葉硝酸鹽含量較烤煙高百倍，進而導致煙葉中TSNAs含量較烤煙高幾十甚至幾百倍，與白肋煙施氮量高、碳代謝水平低和氮素同化能力弱密切相關[3-4]。因此，提高煙葉碳氮代謝水平，從而提高煙葉氮素利用效率和減少施氮量已成為減少硝酸鹽積累量的一條重要途徑，進而為降低煙葉中TSNAs含量奠定基礎。

碳代謝與氮代謝密切相關，氮代謝需要依賴碳代謝提供能量和碳源，碳代謝又需要氮代謝提供酶蛋白和光合色素，且二者需要共同的碳骨架，還原力和ATP[5-6]。前期研究表明，白肋煙煙葉色素含量低、總糖和還原糖形成較少，為氮代謝活動提供碳骨架和能源物質不足，可能是白肋煙硝酸鹽積累的根本原因[7]。

通過追加額外碳源來促進光合作用，增加光合產物的累積，從而促進植物體內氮代謝過程，有利于實現(xiàn)降低煙葉硝酸鹽含量和增加植物產量的效果，這一研究思路已在茄子、韭菜和其他蔬菜作物中應用，且效果顯著[8-9]。適宜濃度的5-硝基愈創(chuàng)木酚鈉[10]、亞硫酸氫鈉和硫酸鈉[11]、硝普鈉[12]、硫磺和水楊酸[13]均能直接影響蔬菜葉片氮關鍵酶活性，促進氮素還原同化進程，從而促進C-N轉運，降低硝酸鹽含量。上述物質均是通過直接影響氮代謝過程從而影響硝酸鹽含量，而丙三醇降低葉片硝酸鹽的積累機理有所不同。

丙三醇，又稱甘油、洋密，是一種無色、無臭、甜味的黏稠狀液體，因其含三個醇羥基，故極易溶于水，可隨水被植物吸收[14-15]。據報道，丙三醇有2000多種用途[16]，廣泛應用于食品業(yè)（包括飲料）、醫(yī)藥業(yè)和化妝品等行業(yè)。丙三醇屬于三碳碳源，不僅為細胞生長和代謝活動提供碳骨架，而且在細胞滲透調節(jié)、光合作用、蔗糖代謝及抗逆性中均能發(fā)揮重要作用[17-18]。在研究萌發(fā)的種子代謝中發(fā)現(xiàn)，丙三醇能通過糖異生作用合成糖類化合物，為種子萌發(fā)一系列代謝活動提供能量和能源物質[19-20]。在葉菜類蔬菜上，噴施1.0%丙三醇后，植株葉片色素含量升高，光合作用增強，硝酸鹽含量顯著性下降[9,21]，但有關其效應及影響機理尚不明確。目前，關于降低白肋煙煙葉硝酸鹽的調控措施多集中在調制和貯藏過程中，針對新鮮煙葉的調控措施涉及不多，有關施用丙三醇降低硝酸鹽的研究中也未見其作用過程和作用機理的報道。本試驗以苗期白肋煙品種TN90和TN86為材料，通過設置不同丙三醇濃度試驗，確定其降低煙葉硝酸鹽含量的最佳適宜濃度，并研究其在低氮和高氮水平下對煙苗色素含量、碳氮代謝關鍵酶活性和碳氮化合物含量的影響，為闡明丙三醇降低硝酸鹽積累機理，建立有效的煙葉硝酸鹽累積減控措施和降低煙葉TSNAs含量提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 煙草材料和培育條件

試驗在河南農業(yè)大學國家煙草栽培生理生化研究基地氣候室進行。氣候室條件設置：溫度為22℃～28℃，每12 h晝夜交叉光照（白天時間段設置為Am 7：00-Pm19：00），光照 800 μmol m-2s-1，濕度 85%。選用白肋煙品種TN90和TN86。煙草種子在2%次氯酸鈉中消毒2次，每次5 min，隨后將其播種在填滿基質的200孔育苗盤中。待煙苗長至4～5煙葉（苗齡40 d左右）時，選取長勢均勻一致的壯苗，移栽到填滿基質的小花盆中，1株/盆。營養(yǎng)液配置按照霍格蘭法配置，NO3-N：NH4-N = 3：1。

1.2 試驗設計

1.2.1 不同丙三醇濃度篩選試驗

移栽后10 d，選取長勢均勻一致的煙株，開展不同丙三醇濃度篩選試驗。結合前期不同丙三醇濃度預試驗結果，試驗設置0.025%，0.05%，0.075%，0.10%，0.15%和0.20%丙三醇濃度，TN86和TN90兩個品種各進行7個濃度處理，每個處理選取5株煙，3次重復。于上午9點進行噴施不同濃度丙三醇溶液，葉片正反面均勻噴施，至葉片上的溶液形成均勻的液滴為止，對照采用同等量的蒸餾水。在噴施后7 d，分別對兩個品種不同處理煙葉NO3-N含量進行測定，以篩選出降低煙葉硝酸鹽含量的最佳濃度。

1.2.2 減氮條件下施用丙三醇對煙葉碳氮代謝的調控作用

在確定丙三醇最佳適用濃度后，開始進行減氮條件下施用丙三醇調控試驗。以TN90作為試驗材料，移栽時，選取長勢均勻一致的煙苗，進行饑餓處理1 d，然后供給不同氮水平營養(yǎng)（24 mM和14 mM）進行培養(yǎng)，一周后，再進行噴施丙三醇處理，噴施濃度為丙三醇最佳適用濃度0.1%，噴施方式同上，每個處理選取6株煙，3次重復。噴施3 d、5 d、7 d、10 d、15 d后進行取樣。將各處理煙苗平均分成 3 份，分別用于新鮮樣本檢測、新鮮樣本保存（超低溫冰箱-80℃中保存）和殺青樣本保存。

1.3 測定項目和方法

1.3.1 生物量積累測定

選取處理后長勢一致的煙株，將其根、莖和葉片在烘箱中105℃殺青20 min，60℃烘干至恒重，稱重，磨碎，過60目篩子，主要用于煙株生物量積累和化學成分測定。

1.3.2 煙葉色素、可溶性蛋白質含量和氮代謝酶活性測定

選取各處理長勢均勻一致的煙苗，選擇最大功能葉6-8支脈之間葉肉，用剪刀將其剪成2 mm ×5 mm條狀，混勻后，用于測定煙葉NR活性、GS活性、可溶性蛋白質和色素含量等。應用O?Neal等[22]方法測定煙葉GS活性，色素含量采用95%乙醇測定，NR活性采用活體法測定，可溶性蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定[23]，具體方法均參照李合生植物生理生化實驗指導說明書進行。

1.3.3 煙葉硝酸鹽和常規(guī)化學成分測定

煙葉NO3-N含量采用濃H2SO4-水楊酸法測定[24]，煙葉總氮、總糖和還原糖含量按照國家煙草行業(yè)標準YC/T161，159-2002在流動分析儀上完成檢測[25]。

煙葉氮素積累量和氮素利用效率計算方法：

煙葉氮素積累量（mg/株）=煙葉總氮含量（%，g/100g）×葉干重（g/株）×10

煙葉氮素利用效率（N utilization efficiency，NUE單位：mg DW/mg N） =葉片干物重/煙葉氮素積累量

1.3.4 目標基因qRT-PCR 測定

根據 GenBank 中EGY1基因（Gene ID：833476）序列、CP12-2基因（Gene ID：825214）序列、PGK基因（Gene ID：107787830）序列、PPC16基因（Gene ID：547769）序列、GLPK基因（Gene ID：109221820）序列、SPS基因（Gene ID：107766133）序列、SUS2基因（Gene ID：109214879）序列、NIA1基因（Gene ID：107823732）序列、NLP7 基因（Gene ID：828502）序列、NPF7.3基因（Gene ID：840139）序列，分別設計特異性引物，具體如表1。按反轉錄試劑盒說明書合成 cDNA 第一鏈，以 cDNA 為模板, 按SYBR Premix Ex Taq II （Tli RNaseH Plus）說明書進行 qRT-PCR。反應體系含QuantiFast? SYBR? Green PCR Master Mix（2×）10 μL、PCR Forward Primer（10 μM ×）0.2 μL、PCR Reverse Primer（10 μM×）0.2 μL、Nuclease-free H2O 0.4 μL、cDNA 模板1 μL。反應程序為，95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火及延伸30 s，40 個循環(huán)，每個處理 3 次重復，每個反應 3 次重復。根據擴增曲線確定每個基因的響應 Ct 值，以 L25 為內參矯正 PCR 模板的拷貝數，采用 2-ΔΔCt方法計算基因相對表達量。

1.4 數據分析

采用Excel和Origin pro 9.0軟件進行數據分析和制圖；采用SPSS 24.0軟件和LSD法，對不同化學調控處理間煙葉生物量積累、色素含量、NR和GS活性、可溶性蛋白質、總氮、總糖、還原糖和NO3-N含量進行多重比較和方差齊性檢驗。

2 結果與分析

2.1 白肋煙苗期施用丙三醇的適宜濃度篩選

由圖1可知，不同丙三醇濃度對煙葉NO3-N含量的影響不同。本試驗條件下，在0.025%～0.15%濃度范圍內，施用丙三醇均能降低煙葉NO3-N含量，差異達到顯著或極顯著水平，且以0.1%濃度的降低效果最佳；在施用丙三醇0.2%濃度時，煙葉NO3-N含量與對照差異較小，且對煙苗葉片有一定的灼傷現(xiàn)象，可能與丙三醇具有較強的吸濕性有關，若施用濃度過高，易引起胞內水分外泄，造成細胞嚴重失水和產生不可逆的傷害。由此可知，在苗期，噴施不同丙三醇濃度對降低白肋煙煙葉NO3-N含量的效果，以0.1%處理最佳。

2.2 減氮條件下施用丙三醇對生物量積累的調控作用

煙葉生物量積累數量是煙株碳氮代謝活動的綜合結果，在一定程度上能夠體現(xiàn)出煙苗素質情況。由圖2可知，在低氮條件下，噴施丙三醇15 d后，煙葉和地上部分生物量積累數量分別升高了13.36%和14.75%，差異達顯著或極顯著水平；在高氮條件下，噴施丙三醇15 d后，煙葉和地上部分生物量積累數量分別升高了10.20%和9.97%，差異均達顯著性水平。由此說明，不同施氮水平下噴施丙三醇對增加煙葉生物量積累和壯苗有積極作用。

2.3 減氮條件下施用丙三醇對煙葉色素和可溶性蛋白質含量的調控作用

由圖3可知，在低氮條件下，噴施丙三醇后15 d，煙葉色素含量和可溶性蛋白質含量分別升高了14.48%和12.79%；在高氮條件下，噴施丙三醇15 d后，煙葉色素含量和可溶性蛋白質含量分別升高了45.71%和35.76%，且低氮條件下噴施丙三醇后，煙葉色素和可溶性蛋白質含量與高氮條件下對照處理相近，由此說明，減氮條件下噴施丙三醇能促進煙葉色素和蛋白質合成，對降低煙葉硝酸鹽含量有利。

圖2 不同氮水平下施用丙三醇對煙葉葉片和地上部分生物量積累影響Fig.2 Effect of foliar application of glycerol on biomass accumulation in leaves and above-ground parts of tobacco under different nitrogen levels

圖3 不同氮水平下施用丙三醇對煙葉色素和可溶性蛋白質含量的影響Fig.3 Effect of foliar application of glycerol on pigment and soluble protein content in tobacco leaves under different nitrogen levels

2.4 減氮條件下施用丙三醇對煙葉總糖和還原糖的調控作用

由圖4可知，在不同施氮條件下，施用丙三醇對煙葉總糖和還原糖含量的影響不同。其中，在高氮和低氮處理中，噴施丙三醇15 d后，煙葉總糖和還原糖含量均呈現(xiàn)出升高趨勢，且差異均達到極顯著性水平。在低氮條件下，噴施丙三醇后，煙葉總糖和還原糖含量分別升高了47.76%和44.57%；在高氮條件下，噴施丙三醇后，煙葉總糖和還原糖含量分別升高了25.15%和32.84%，且低氮條件下噴施丙三醇后，煙葉總糖和還原糖含量高于高氮條件下空白處理，由此說明，減氮條件下噴施丙三醇能促進碳固定能力，促進碳水化合物合成，為煙葉還原同化和其他代謝過程提供充足碳源，對降低煙葉硝酸鹽含量和提高煙葉產量有利。

圖4 不同氮素處理煙葉總糖和還原糖含量比較Fig.4 Comparison of total sugar content and soluble reducing sugar content in tobacco leaves under different nitrogen levels

2.5 減氮條件下施用丙三醇對煙葉總氮和氮素積累量的影響

由圖5可知，在不同施氮條件下，施用丙三醇對煙葉總氮和氮素積累量的影響不同。其中，在高氮和低氮處理中，噴施丙三醇15 d后，煙葉總氮含量均有下降趨勢，但處理與對照相比差異未達到顯著性水平，而煙葉氮素積累量呈現(xiàn)出升高趨勢，且低氮條件下差異達到極顯著性水平。在低氮條件下，噴施丙三醇后，煙葉總氮含量下降了2.98%，煙葉氮素積累量升高了10.21%；在高氮條件下，噴施丙三醇后，煙葉總氮含量下降了6.37%，煙葉氮素積累量升高了3.15%，一方面說明，噴施丙三醇增加煙葉生物量積累，從而使煙葉氮素積累量呈現(xiàn)增加趨勢；另一方面表明，噴施丙三醇能促進煙株碳氮代謝，對增加生物量積累和煙苗素質有積極作用。

圖5 不同氮水平下施用丙三醇對煙葉總氮和氮素積累量的影響Fig.5 Effects of foliar application of glycerol on total nitrogen content and nitrogen accumulation in tobacco leaves under different nitrogen levels

2.6 減氮條件下施用丙三醇對煙葉NO3-N含量的調控作用

由圖6可知，在高氮和低氮條件下，噴施丙三醇后7 d，煙葉NO3-N含量分別下降了59.67%和53.22%。由此說明，噴施后7 d，丙三醇對煙葉NO3-N含量的降低效果最明顯；煙葉NO3-N含量在達到最低值后又呈現(xiàn)出升高趨勢，結合煙葉NR和GS活性的表現(xiàn)情況推測，可能是由于其在促進氮同化作用的同時也促進了氮素吸收作用。

2.7 減氮條件下施用丙三醇對煙葉氮代謝關鍵酶活性的調控作用

圖6 不同氮水平下施用丙三醇對煙葉NO3-N含量的影響Fig.6 Effect of foliar application of glycerol on NO3-N content in tobacco leaves under different nitrogen levels

圖7 不同氮水平條件施用丙三醇對煙葉NR和GS活性的影響Fig.7 Effect of foliar application of glycerol on activities of NR and GS in tobacco leaf under different nitrogen levels

由圖7可知，在不同施氮條件下，噴施丙三醇對煙葉NR和GS活性的影響不同。在低氮條件下，噴施丙三醇后，煙葉NR活性呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，在噴施后5 d達到最大值，而GS活性呈現(xiàn)出先下降后持續(xù)升高趨勢；在高氮條件下，噴施丙三醇后，煙葉NR活性呈現(xiàn)出先升高后下降再升高的趨勢，即在噴施后3 d達到第一個峰值，隨后出現(xiàn)下降趨勢，在噴施后7 d達到最小值的峰值，隨后又呈現(xiàn)出升高趨勢，可能是由于硝酸還原酶是一種誘導酶，受底物NO3-含量影響發(fā)生變化，進一步解釋了硝態(tài)氮的變化現(xiàn)象，而GS活性則呈現(xiàn)出先下降后持續(xù)升高趨勢，由此說明噴施丙三醇能迅速提高煙葉NR活性，對GS活性的促進作用較對NR活性作用滯后，對促進氮同化作用和硝酸鹽含量有利。

2.8 減氮條件下施用丙三醇對煙葉氮素利用效率的影響

氮素利用效率反映植株地上部吸收利用氮肥的能力，其大小與葉片硝酸鹽含量密切相關。由圖8可知，在不同施氮水平下，噴施丙三醇均能提高葉片氮素利用效率。其中，在高氮條件下，噴施丙三醇15 d后，煙葉氮素利用效率提高了6.81%，差異達顯著水平，且煙葉氮素利用效率在低氮水平噴施丙三醇條件下高于高氮水平不噴施丙三醇，與丙三醇促進生物量積累，增加氮素同化利用能力有關。

2.9 不同處理煙葉碳氮代謝途徑關鍵基因表達分析

圖8 不同氮水平下施用丙三醇對氮素利用效率的影響Fig.8 Effect of foliar application of glycerol on nitrogen utilization efficiency in tobacco leaves under different nitrogen levels

高氮條件下噴施丙三醇2 d后，對白肋煙煙葉碳氮代謝途徑關鍵基因表達進行分析，結果（圖9）顯示，噴施丙三醇后，參與光反應的基因EGY1和CP12-2，碳固定途徑基因PGK、PPC16和GLPK，蔗糖合成基因SPS和SUS2-2以及硝酸鹽轉運和還原同化基因表達量均顯著上調。與對照相比，基因CP12-2、PPC16和NPF7.3的表達量增加0.5倍多，表明丙三醇能增強白肋煙煙葉光合作用、碳固定和硝酸鹽轉運同化能力，促進碳水化合物的合成和降低煙葉硝酸鹽積累量。

圖9 高氮條件下丙三醇處理煙葉碳氮代謝關鍵基因表達情況Fig.9 Expression of key genes in carbon and nitrogen metabolism pathway in tobacco leaves with foliar application of glycerol under high nitrogen level

3 討論

前期研究表明，白肋煙煙葉NR和GS活性相對較低，氮同化能力弱，是引起煙葉硝酸鹽大量積累的重要原因；色素含量低、總糖和還原糖形成較少，為氮代謝活動提供碳骨架和能源物質不足，可能是白肋煙硝酸鹽積累的根本原因[7]。丙三醇屬于一種三碳碳源，具有良好的水溶性，能夠在光合作用不足的情況下提供碳源，對降低植株硝酸鹽含量具有突出的效果[26]。前期試驗中，我們通過施用不同外源物質調控白肋煙煙葉氮代謝中發(fā)現(xiàn)，噴施丙三醇能降低煙葉硝酸鹽含量，且效果顯著。徐廣輝等[9]研究發(fā)現(xiàn)，1.0%的丙三醇可顯著降低韭菜硝酸鹽含量，提高韭菜產量。本試驗條件下，在0.025%～0.15%濃度范圍內，噴施丙三醇后均能明顯降低煙葉硝酸鹽含量，且以0.1%濃度處理效果最佳，韭菜和白肋煙所需濃度不同，可能與作物種類有關；噴施丙三醇后，煙葉色素和蛋白質含量有明顯的升高趨勢，與徐廣輝[9]和龐強強等[23]的研究結果較為一致。徐光輝[27]的研究也表明，丙三醇可降低茄子和小白菜硝酸鹽含量，且可溶性糖含量和品質顯著提高。本次試驗研究中，在高氮和低氮水平下，噴施丙三醇15 d后，煙葉生物量、總糖和還原糖含量顯著升高；同時在低氮條件和高氮條件下，噴施丙三醇后，煙葉NR活性迅速升高，GS活性呈現(xiàn)出持續(xù)升高趨勢，可能是由于噴施丙三醇后，煙葉色素含量增加，碳固定能力增強，總糖和還原糖等能源物質增加，有助于氮還原同化作用增強。在本試驗中，不同施氮水平下噴施丙三醇后，煙葉氮素積累量和蛋白質含量呈現(xiàn)升高趨勢，但煙葉總氮和硝態(tài)氮含量降低，其中，不同施氮水平下噴施丙三醇7 d后，煙葉硝酸鹽含量顯著下降，說明丙三醇可以促進白肋煙氮素還原同化能力，有利于實現(xiàn)促進煙葉硝酸鹽還原同時又能促進氮素同化，對降低煙葉硝酸鹽有正面作用。

硝酸鹽一旦儲藏便很難被利用[28]，白肋煙硝酸鹽運輸能力低于其他類型煙草[7]，NPF3.1和NPF7.3是低親和力質子依賴的雙向硝酸鹽轉運子，調控亞硝酸鹽進入葉綠體和硝酸鹽進入木質部的過程[29]。NLP7是參與初級NO3-響應的一個重要轉錄因子，能過對氮代謝過程中一些關鍵基因（NRT2.1、NITR2:1、NIA1、NIR1）進行調節(jié)，在硝酸鹽響應過程中起到正向調節(jié)的作用[30]。本試驗中進一步基因表達分析結果表面，噴施丙三醇使煙葉白肋煙煙葉NPF7.3、NIA1等硝酸鹽轉運、還原和NLP7基因表達量顯著上調，且NRA、GSA和氮同化產物（可溶性蛋白質含量）提高，硝酸鹽含量降低。由此說明，丙三醇調控煙葉氮素轉運、還原和同化過程，從而影響煙葉硝酸鹽含量。

光既是一種能量來源又是一種刺激信號，參與調控植物體內許多代謝過程[31]。且光通過在光合系統(tǒng) II和光合系統(tǒng) I 中一系列的能量轉化及電子傳遞，可參與調控碳固定和氮還原過程[32]。噴施丙三醇后，響應光刺激相關基因EGY1和CP12-2，碳固定和糖類物質合成相關基因CP12-2、EGY1、PGK、PPC16、GLPK、SPS和SUS2-2表達水平顯著上調，與生物量積累和碳水化合物含量變化趨勢一致。與對照相比，基因CP12-2、PPC16和NPF7.3的表達量增加0.5倍多，表明噴施丙三醇可以使煙葉保持較強的碳氮代謝水平，能夠實現(xiàn)降低煙葉硝酸鹽含量的目的。近些年來，國內外學者研究表明，煙葉硝態(tài)氮含量與施氮量呈正相關，氮肥用量過大是造成作物NO3-積累過多的直接原因之一[33-34]，因此通過減氮配合噴施丙三醇能夠在獲得相同生物量的情況下達到降低煙葉硝酸鹽含量的目的，進而實現(xiàn)煙葉減肥增效和減害，有待于進一步研究和在大田條件下驗證。

4 結論

不同施氮水平下噴施丙三醇能顯著提高白肋煙煙葉生物量、色素、蛋白質、氮素積累量、氮素利用效率和碳水化合物含量，而總氮和硝酸鹽含量呈現(xiàn)下降趨勢?；虮磉_分析結果表明，噴施丙三醇后，白肋煙煙葉碳固定相關基因EGY1、CP12-2、PGK、PPC16和GLPK，糖類物質合成相關基因SPS和SUS2-2，硝酸鹽轉運和還原同化相關基因NPF7.3、NIA1和NLP7表達水平顯著上調。丙三醇通過調控煙葉碳固定和氮素轉運、還原同化能力，影響煙葉碳氮代謝，促使白肋煙煙葉碳水化合物含量增加和硝酸鹽積累量減少。