UBE2T基因表達對鼻咽癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響

鄭志剛 華清泉 陳 鋒

鼻咽癌是耳鼻喉科常見的嚴重癌癥之一，我國南方是鼻咽癌的高發(fā)區(qū)，發(fā)病因素可能與環(huán)境氣候有關[1]。對于鼻咽癌的治療臨床上目前有多種治療方法，但手術過程繁瑣并且患者預后不佳[2]，對于這一問題的改進，本研究中創(chuàng)新性的應用了UBE2T基因表達的方式以通過泛素-蛋白酶體途徑作用于鼻咽癌中半衰期較短的蛋白和一些結構異常、錯構且易于檢測觀察的蛋白[3]，再此蛋白的基礎上通過轉染UBE2T特異性siRNA載體，采用MTT法檢測與鼻咽癌相關的5-8F細胞增殖、采用Transwell 遷移侵襲試驗檢測5-8F細胞侵襲及轉移并利用Western blotting法檢測5-8F細胞中逆轉錄的UBE2T蛋白表達于鼻咽癌中的顯像效果[4]。為此，筆者探討UBE2T基因表達對鼻咽癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響從而研究出鼻咽癌5-8F細胞可成為鼻咽癌治療的分支靶標。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

材料主要包含：鼻咽癌細胞系5-8F細胞，空白載體，UBE2T特異性siRNA載體，轉錄酶和逆轉錄酶。試劑主要有：TRIZOL試劑、秋水仙素、龍膽紫溶液、無酶的RNA沖洗液、SYBR Green 1 染料、上游引物、下游引物、dNTP。Western blotting檢測試劑：30克丙烯酰胺和0.8克N,N'-亞甲丙烯酰胺、4×Tris·cl/SDS,pH 8.8、4×SDS電泳緩沖液、TEMED (N,N,N'，N'-四甲基乙二胺)、10%過硫酸銨。MTT法檢測試劑：MTT 0.5克，100 ml的磷酸緩沖液(PBS)或無酚紅的培養(yǎng)基。Transwell 遷移侵襲試驗試劑：無血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM、 1640完全培養(yǎng)基(也可加到20%血清)，無菌PBS，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，結晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS結晶紫)。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉染

將5-8F細胞放入瓊脂培養(yǎng)基中放入細胞保溫箱中進行傳代培養(yǎng)后，將培養(yǎng)后的細胞隨機分為3組即對照組、空白轉染組和si-UBE2T組。其中對照組不做任何處理；空白轉染組細胞轉染空白載體；si-UBE2T組細胞轉染UBE2T特異性siRNA載體。分別采用MTT法檢測各組細胞增殖情況，采用Transwell遷移侵襲試驗檢測各組細胞遷移和侵襲，Western blotting法檢測各組細胞UBE2T蛋白表達，4～6周期后分別對3組實驗結果進行測量與統(tǒng)計，并分析數據結果。

1.3 Western blotting檢測

將3組細胞分別進行Western blotting法檢測，將培養(yǎng)好的5-8F細胞放在兩塊干凈的玻璃平板之間離心后備用，將配制好的 聚丙烯酰胺分離膠液體并脫氣，然后放入10%的過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌混勻。按所需分離的蛋白質分子大小選擇合適的丙烯酰胺百分比濃度，將以上兩種材料進行充分混合后將分離好的5-8F細胞與混合液一起孵育30 min后進行充分清洗，再將硝酸纖維素膜與5-8F細胞進行混合后顯色。

1.4 MTT法檢測

將3組細胞分別進行MTT法檢測，取凍存的5-8F細胞，按照10 000 r/min的離心速度進行離心分離，每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯仿，進行裂解操作，4攝氏度冰上采用無酶的RNA沖洗液進行洗滌，再次10 000 r/min離心5 min，得到RNA。將此RNA進行逆轉錄后再培養(yǎng)以檢測各組細胞增殖情況。

1.5 Transwell 遷移侵襲試驗

將3組細胞分別進行Transwell 遷移侵襲試驗，取凍存的5-8F細胞，按照20 000 r/min的離心速度進行離心后應用基質膠鋪板后制備5-8F細胞懸液后檢測各組細胞遷移和侵襲情況。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 各組細胞UBE2T蛋白表達比較

si-UBE2T組UBE2T蛋白相對表達量明顯低于對照組和空白轉染組(P<0.05)；對照組和空白轉染組UBE2T蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1和圖1。

表1 各組UBE2T蛋白表達比較

注：a為與si-UBE2T組比較，P<0.05。

1為對照組；2為空白轉染組；3為si-UBE2T組。

2.2 各組細胞增殖情況比較

各組細胞培養(yǎng)開始時吸光度值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；si-UBE2T組培養(yǎng)第1 d、3 d和6 d吸光度值均低于對照組和空白轉染組(P<0.05)；對照組和空白轉染組培養(yǎng)第1 d、3 d和6 d吸光度值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組細胞增殖的吸光度值比較

注：a為與si-UBE2T組比較，P<0.05。

2.3 各組細胞遷移能力比較

si-UBE2T組細胞遷移率明顯低于對照組和空白轉染組(P<0.05)；對照組和空白轉染組細胞遷移率比較不具統(tǒng)計學差異，(P>0.05)，見表3。

表3 各組細胞遷移能力比較

注：a為與si-UBE2T組比較，P<0.05。

2.4 各組細胞侵襲能力比較

si-UBE2T組穿膜細胞數明顯低于對照組和空白轉染組(P<0.05)；對照組和空白轉染組穿膜細胞數比較不具統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表4和圖2。

表4 各組穿膜細胞數比較

注：a為與si-UBE2T組比較，P<0.05。

1為對照組；2為空白轉染組；3為si-UBE2T組。

3 討論

鼻咽癌的病理病因目前認為與3種因素有關，即遺傳因素、病毒因素(主要為EB病毒感染)和環(huán)境因素，對于鼻咽癌的治療臨床上方法很多但治療效果都不確切，本文主要從基因表達層面尋求鼻咽癌治療的新靶標[5]。

UBE2T基因是1種近年來被發(fā)現(xiàn)的泛素偶聯(lián)蛋白酶，該基因所獨特的高表達性與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有密切關系[6]，UBE2T基因通過5-8F細胞的上皮間充質胚胎轉化后在鼻咽癌的疾病進程中起到癌基因的作用，UBE2T基因能通過抑制鼻咽癌抑癌基因的表達從而促進鼻咽癌細胞的增值、轉移和侵襲[7]。本研究證實UBE2T基因對鼻咽癌細胞的干細胞特性具有調控作用，并且證明了UBE2T能夠經特異性siRNA載體來調控鼻咽癌相關基因的表達，從而實現(xiàn)其增強鼻咽癌干細胞特性的作用，因此在本研究中顯示，可以將UBE2T基因作為鼻咽癌靶向治療的分支基因靶點[8]，定位準確，療效確切。

通過對UBE2T特異性siRNA載體的檢測5-8F細胞增殖、遷移及侵襲能力。采用MTT法檢測各組細胞增殖情況，MTT法是1種檢測鼻咽癌細胞存活和生長的方法，在本研究中的檢測原理是5-8F細胞RNA中的琥珀酸脫氫酶，能使外源性MTT氧化還原為不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能[9]。當細胞增值時并不影響藍紫色結晶甲瓚存在于5-8F細胞中的數量，會隨著細胞增值而分裂增多，伴隨在細胞質中不斷裂解為更小的粒子，當5-8F細胞增值趨向最大化完成時，二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在700 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活5-8F細胞增值的數量[10]。在細胞數量處于可控的范圍內時MTT結晶形成的量與細胞數成正相關[11]。MTT法特點是靈敏度高、經濟，對于測量出的細胞增值的數量數據準確可靠。

采用Transwell檢測各組5-8F細胞遷移和侵襲，Transwell檢測實驗是指將5-8F細胞放入培養(yǎng)板中，培養(yǎng)板中存在上下兩個小室，在本研究中上下兩個小室內分別存有5-8F細胞上下兩層的層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔[12]。應用此膜可將5-8F細胞從不同孔徑和經過不同處理的聚碳酸酯膜進行細胞遷移、侵襲的研究[13]。

本研究中還需應用Western blotting法檢測各組細胞UBE2T蛋白表達，該方法是采用聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，被檢測物是5-8F細胞轉錄后的UBE2T基因蛋白[14]。經過PCR擴增分離后蛋白質樣品，轉移到固相載體如瓊脂膠體上，固相載體吸附蛋白質后仍能保持電泳分離的UBE2T蛋白的表達基因的活性[15]。

本研究中表1顯示si-UBE2T組UBE2T蛋白相對表達量均值較低說明表達的基因產物與鼻咽癌的特異性較高。表2顯示si-UBE2T組培養(yǎng)數天后有較低的吸光度值，說明UBE2T基因表達后的有較多的5-8F細胞增值，表示鼻咽癌在此種基因的調控下可發(fā)生增值轉移至其他組織器官中甚至會累及到較多的淋巴細胞。表3顯示si-UBE2T組細胞遷移率在培養(yǎng)觀察數天后較低，說明對于鼻咽癌5-8F細胞有較高的遷移基因的表達性有像內臟器官遷移的危險。表4顯示si-UBE2T組穿膜細胞數較低，說明在鼻咽癌5-8F細胞進行基因表達后對周圍組織有較強的侵襲性。

本研究的創(chuàng)新性在于首創(chuàng)的利用UBE2T基因表達對鼻咽癌進行靶向定位治療，可免去臨床上其他手術治療的繁瑣性和增強患者預后，細胞增值率、轉移率和侵襲周圍其他組織的概率大大降低，值得臨床其他難治性手術的借鑒。

綜上所述，UBE2T基因表達對鼻咽癌細胞增殖、遷移及侵襲能力有影響，能夠通過UBE2T基因表達定向治療作為鼻咽癌分支靶向治療的靶標。