秦嶺紅豆杉不同部位黃酮含量及其抗氧化性研究

王云云, 華燕青, 胡永樂, 羅長浩

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥物與化工分院,陜西 楊凌 712100 ;2. 周至國家自然保護(hù)區(qū),陜西 周至 710400 )

紅豆杉止痛、解毒、散結(jié)，內(nèi)含紫杉醇和黃酮。臨床上主要用于治療卵巢癌、肺癌、食管癌等惡性疾病，被廣泛地應(yīng)用在醫(yī)藥和食品中。文獻(xiàn)顯示已從紅豆杉屬植物中分離出500多種紫杉烷類化合物。利用乙醇對紅豆杉的針葉進(jìn)行提取和分離，并對總黃酮提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選，并與傳統(tǒng)的乙醇回流進(jìn)行對比，獲得了較為理想的黃酮提取工藝參數(shù)。

秦嶺是我國南北氣候、植被、動(dòng)植物區(qū)系的分界線，山勢巍峨，地勢起伏較大，野生紅豆杉資源豐富，主要為南方紅豆杉和西藏紅豆杉，其中南方紅豆杉分布較多[1]。所生紅豆杉桿形端正，生長健康，枝葉蒼翠，無病害。筆者試驗(yàn)借鑒前人的研究成果，對秦嶺野生紅豆杉不同部位的黃酮含量進(jìn)行試驗(yàn)，用超聲波提取法，對其提取液進(jìn)行含量分析和對照，以期得到秦嶺紅豆杉不同部位在總黃酮量，通過分析比對為開發(fā)豐富的秦嶺紅豆杉藥物資源，提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AR2140電子天平，RE-522AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，SG2200HE超聲波(上海冠特超聲儀器有限公司)，UV-1800紫外可見分光光度計(jì)(日本島津)，SHB-3T循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)易有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

紅豆杉，采于2016年10月27日陜西周至自然保護(hù)區(qū)。經(jīng)楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院陳書文教授鑒定為紅豆杉科，紅豆杉屬南方紅豆杉。將樣品按枝干、樹皮、葉三部分分別干燥后，粉碎過60目篩，制成紅豆杉粉待用。蘆丁對照品(批號(hào)：B20771-20 mg B20 10Y19N7525244 CSA#153-18-4 )購自上海源葉生物科技有限公司，無水乙醇，亞硝酸鈉，氫氧化鈉，硝酸鋁三羥甲基氨基甲烷， HCl， Na2EDTA，連苯三酚均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱量于105℃干燥至恒重的蘆丁對照品12.01 mg，用70%乙醇溶解，定容于50 mL容量瓶中，得0.242 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2 最大吸收波長的選擇

取對照品溶液和供試品溶液進(jìn)行波長掃描，發(fā)現(xiàn)在500 nm附近吸收較強(qiáng)，故選擇500 nm作為測定波長。見圖1。

圖1 供試品紫外掃描光譜

2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL、1.2 mL、1.5 mL、1.8 mL，分別加入去離子水到2 mL。加5%硝酸鈉溶液0.5 mL,放置6 min，加5 mL 1 mol·L-1NaOH溶液，搖勻，室溫放置10 mim，在500 nm處測吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖1。線性回歸方程為C=0.0772A-0.0057， r=0.984148，蘆丁在0.0356～0.4984 mg的范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取2.1項(xiàng)下蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0 mL，依2.3項(xiàng)中顯色方法操作，連續(xù)6次測定吸光度，結(jié)果RSD=1.609%。表明儀器的精密度良好。測量結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗(yàn)

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

量取同一供試品溶液0.5 mL,依供試品溶液制備成供試品溶液，顯色，經(jīng)15 min、30 min、45 min、60 min、75 min測吸光度。結(jié)果RSD=1.16%，表明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

取已知濃度的樣品溶液6份，加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，依供試品溶液的制備方法制備并顯色，測總黃酮，結(jié)果平均回收率為98.52%，RSD=1.71%，表明該方法的準(zhǔn)確性良好，方法可行。

3 方法與結(jié)果

3.1 紅豆杉總黃酮提取工藝及工藝參數(shù)確定

紅豆杉總黃酮超聲提取擬采用工藝為：

3.2 超聲提取不同部位總黃酮

表2 取樣量及稠膏量

三角瓶中加入不同部位紅豆杉皮、枝、葉60目粉末，液料比27(V/m)，乙醇體積分?jǐn)?shù)64%，提取時(shí)間55 min,超聲頻率59 kHz，提取次數(shù)2次，制備供試品溶液的原液的濃縮液。見表2。

3.3 黃酮含量的測定

取3.2項(xiàng)下的濃縮液1 mL，用NaNO2—Al(OH)3—NaOH顯色， 70%乙醇定容于25 mL，為供試品溶液?？傸S酮的計(jì)算方法為：總黃酮的含量(mg·g-1)=總黃酮的量/紅豆杉樣品質(zhì)量。測定結(jié)果見表3。黃酮含量比較見圖3。

表3 紅豆杉不同部位總黃酮含量

圖3 紅豆杉不同部位黃酮含量比較

3.4 抗氧化活性

3.4.1 溶液配制 三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液(0.1 mol·L-1)；HCl溶液(0.1 mol·L-1)；Tris-HCl緩沖液(0.05 mol·L-1, pH7.4，含1mmol·L-1Na2EDTA)；60 mmol·L-1連苯三酚溶液。

3.4.2 參比液清除能力測定 試管中加11.8 mL Tris-HCl緩沖液，再加0.2 mL連苯三酚溶液,快速混合后倒入比色皿中，計(jì)時(shí)開始，隔30 s一次A值(325 nm)，至300 s(5 min)時(shí)為止。共三次。

表4 紅豆杉不同部位自由基清除能力比較

3.4.3 樣品溶液自由基清除能力測定 取超聲提取干膏粉,用75%乙醇定容于50 mL容量瓶中，試管中加超濾液2 mL，加0.05 mol·L-1, pH7.4的Tris-HCl緩沖液9.8 mL, 加60 mmol·L-1連苯三酚溶液0.2 mL，混合后倒入比色皿中，開始計(jì)時(shí)，每隔30 s讀數(shù)一次A值(325 nm)，至300 s(5 min)時(shí)為止。共三次。數(shù)據(jù)見表4。

空白參比: △A=A325nm,300s-A325nm,30s

樣品清除率=(△A空白-△A樣)/ △A空白* 100

4 分析與結(jié)論

由上表3可見，以蘆丁為對照品，用紫外分光光度法，以500 nm為測定波長，利用超聲波提取法，選液料比27(V/m)，乙醇體積分?jǐn)?shù)64%，提取時(shí)間為55 min,超聲頻率為59 kHz，提取2次；顯示秦嶺紅豆杉的皮部、枝部、葉部的總黃酮含量為56.6 mg·g-1、 30.13 mg·g-1、33.34 mg·g-1。其中皮部57.51 mg·g-1最高，枝部30.13 mg·g-1最低，葉部總黃酮33.34 mg·g-1。皮部的總黃酮量比枝部高27.38 mg·g-1，比葉部高23.26 mg·g-1,葉部和枝部的含量差異為3.21 mg·g-1，皮部的總黃酮含量是枝部總黃酮的近1倍，枝部和葉部的含量差異不是很大。

由表4可見，紅豆杉的皮、枝、葉部黃酮均具有抗氧化活性，其皮、枝、葉中的自由基清除能力依次76．16、47．22、60．48。皮部的抗氧化能力相對較強(qiáng)，枝部的最弱，抗氧化能力與相應(yīng)部位的黃酮含量相對應(yīng)。

數(shù)據(jù)顯示在秦嶺紅豆杉開發(fā)利用時(shí)，若果以黃酮為活性目標(biāo)物質(zhì)，應(yīng)選擇紅豆杉的皮為原料，這樣可獲得較多的總黃酮產(chǎn)品，提取效率高，經(jīng)濟(jì)收益較大。