一份安康野桑蠶線粒體COI序列的克隆和分析

李 靜，楚 渠，王瑞嫻，彭云武，梁嘉俊，凌 君，孟 剛

(1.安康學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院 , 陜西 安康 725000; 2.安康學(xué)院 陜西省蠶桑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 安康 725000)

安康位于秦巴山區(qū)腹地，野生資源豐富，是陜西主要的蠶桑生產(chǎn)區(qū)域，具有豐富的蠶桑種質(zhì)資源。野桑蠶與家蠶同屬于鱗翅目昆蟲(chóng)，是家蠶的祖先種，是培育家蠶優(yōu)良種的重要基因資源和科學(xué)研究的寶貴材料[1, 2]。筆者單位長(zhǎng)期以來(lái)從事野桑蠶種質(zhì)的發(fā)現(xiàn)、保存和育種工作，野桑蠶的遺傳特性、親緣關(guān)系分析有利于該種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)與利用的開(kāi)展。昆蟲(chóng)線粒體DNA(mtDNA)是昆蟲(chóng)遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化研究的重要分子標(biāo)記，進(jìn)化速率是核基因組的5～10倍，無(wú)重復(fù)序列且在遺傳過(guò)程中不發(fā)生基因重組、倒位、易位等變異，具有嚴(yán)格的母性遺傳特性[3, 4]。細(xì)胞色素氧化酶I亞基(cytochrome oxidase subunit I, COI)是線粒體DNA中重要的蛋白編碼基因，具有進(jìn)化速率適中、保守性強(qiáng)、堿基變異豐富等特點(diǎn)[5]，可作為種屬系統(tǒng)進(jìn)化研究的良好標(biāo)記，被廣泛引用于種質(zhì)鑒定[6]、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析和分子系統(tǒng)發(fā)育分析。

利用線粒體序列研究野桑蠶聚類(lèi)關(guān)系，一方面可以在分子水平上了解桑蠶的進(jìn)化關(guān)系，另一方面有助于發(fā)掘秦巴山區(qū)豐富的野桑蠶種質(zhì)資源，在蠶品種鑒定、種質(zhì)改良和遺傳育種上具有指導(dǎo)意義。筆者研究對(duì)1份安康野桑蠶線粒體COI基因及其兩端側(cè)翼序列進(jìn)行了測(cè)序比較了其與石泉縣野桑蠶的堿基差異；在此前研究基礎(chǔ)上獲得包括5份安康野桑蠶在內(nèi)的17份中國(guó)野桑蠶、2份日本野桑蠶及31份家蠶線粒體相應(yīng)序列[2, 7, 8]，分析了單位點(diǎn)多態(tài)性和安康野桑蠶的聚類(lèi)關(guān)系，從分子水平上探討安康野桑蠶與不同地理來(lái)源野桑蠶及與家蠶的親緣關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣本

野桑蠶樣本采自陜西省安康市，命名為akc20R2。另外，根據(jù)本單位此前的研究和 GenBank(https://www. ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得來(lái)源于安康漢陰縣、嵐皋縣、漢濱區(qū)及石泉縣(AY301620.2和GU966591.1)等地5份野桑蠶線粒體序列。從GneBank中獲得11份國(guó)內(nèi)野桑蠶、2份日本野桑蠶和31份家蠶(Bombyx mori)，以及天蠶(Antheraea yamamai)、柞蠶(Antheraea pernyi)和黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)等相應(yīng)的線粒體序列。

1.2 線粒體基因組提取和序列擴(kuò)增

采用酚-氯仿法抽提蟲(chóng)體全基因組，該方法獲得的為細(xì)胞核基因組和線粒體基因組的混合物。野桑蠶蛹體用雙蒸水反復(fù)清洗3次后，晾干，置研缽中，液氮冷卻后迅速研磨至粉末，加入DNA抽提緩沖液(EDTA 0.1 mol·L-1，Tris-HCl 0.1mol·L-1，SDS 5 g·L-1)3 mL，消融后轉(zhuǎn)入5 mL潔凈離心管中，加入蛋白酶k(30 unit·mg-1，Sigma)至終濃度為150 μg·mL-1，置50℃水浴箱中消化3～5 h(每30 min混勻1次)。消化后的懸液按酚-氯仿法抽提DNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)量。取1μL樣品經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，基因組條帶應(yīng)位于TransPlus2000 DNA Marker指示劑5 000 bp條帶之上，且電泳條帶清晰明亮。基因組樣本置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物

根據(jù)已登錄的野桑蠶線粒體序列(GU966629.1)，針對(duì)目的片段設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。上游引物為5’-TGGTGCAGGAACAGGATGAAC-3’，下游引物為5’-GAGACCADTACTTGCTTTCAG-3’，預(yù)計(jì)產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 962 bp。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為50 μL，含總DNA模板(20 ng·μL-1) 1.0 μL，ddH2O 35.0 μL，10×緩沖液5.0μL，MgCl2(25mmol·L-1) 5μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1) 2.0 μL，上下游引物(2 μmol·L-1)0.5 μL，高保真聚合酶(5 u·μL-1)1 μL；反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性 40 sec，52℃退火40 sec，72℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，結(jié)束反應(yīng)。

1.4 產(chǎn)物回收和測(cè)序

PCR產(chǎn)物采用1.20%(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切取目的條帶，利用OMIGA膠回收試劑盒(OMIGA Gel Extraction Kit，美國(guó))回收和純化核酸片段，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行?；厥斋@得的PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)合格之后，各選3份送交上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 序列分析

使用Bioedit軟件包逐條校對(duì)測(cè)序峰圖，去除兩端載體序列及機(jī)讀錯(cuò)誤之后導(dǎo)出序列。利用Clustalx軟件進(jìn)行核酸序列的同源性比對(duì)和相似性分析；DnaSP6.0(Rozas et al., 2017)檢測(cè)單倍型和多態(tài)性位點(diǎn), 計(jì)算核苷酸多樣性(Pi)和單倍型(haplotype)多樣度(Hd)。MEGA7.0(Tamura et al.,2007)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，構(gòu)建方法為鄰接法(neighbour-joining method, NJ)，(neighbor-joining)，參數(shù)設(shè)置為Bootstrap=1000，Poisson model，gaps/missing處理方式為pairwise deletion。

2 結(jié)果

2.1 序列擴(kuò)增和凝膠電泳

凝膠電泳檢測(cè)基因組抽提效果，在DNA marker對(duì)應(yīng)的5 000 bp以上位置有單一條帶，表明基因組質(zhì)量可滿足后續(xù)研究。利用線粒體特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果在預(yù)計(jì)的目的位置(1 962 bp)出現(xiàn)明亮、單一的條帶(圖1)，表明成功抽提出野桑蠶線粒體序列，且設(shè)計(jì)合成的特異性引物可擴(kuò)增出目的序列片段?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物，轉(zhuǎn)入克隆質(zhì)粒并擴(kuò)大培養(yǎng)，收集質(zhì)粒送交測(cè)序，獲得擴(kuò)增片段的核酸序列。

圖1 基因組抽提和線粒體目的序列擴(kuò)增檢測(cè)

2.2 序列比對(duì)和核酸多態(tài)性分析

去除序列兩端載體序列及機(jī)讀錯(cuò)誤之后，獲得長(zhǎng)度為1 873 bp的序列，將其進(jìn)行blast比對(duì)，結(jié)果表明該序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中野桑蠶線粒體序列的一致性(identity)最高，且其中包含一段線粒體COI編碼序列。將克隆所得序列與GenBank中的石泉縣野桑蠶序列(AY301620.2和GU966591.1)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，其與石泉野桑蠶序列在163、203、213等48個(gè)核苷酸位點(diǎn)上表現(xiàn)差異。

從GenBank和文獻(xiàn)報(bào)道中獲得16份中國(guó)、日本野桑蠶相應(yīng)的線粒體序列。位點(diǎn)多態(tài)性分析表明，17份中國(guó)野桑蠶在67個(gè)位點(diǎn)上存在堿基差異，平均核苷酸差異為25.596，核苷酸多樣度為0.01368；2份日本野桑蠶在10個(gè)位點(diǎn)上存在差異，平均核苷酸差異為10.000，核苷酸多樣度為0.00534(表1，表2)。與國(guó)內(nèi)四川、江蘇等地的野桑蠶相比，山東青州、陜西安康的野桑蠶有更為豐富的多態(tài)性單位點(diǎn)，同時(shí)安康野桑蠶在群體內(nèi)表現(xiàn)出較高的相似性(表2)。

2.3 遺傳進(jìn)化分析

針對(duì)野桑蠶及家、野桑蠶兩者之間的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了聚類(lèi)分析，其中包括本次克隆所得序列在內(nèi)的6份安康野桑蠶線粒體相應(yīng)序列(圖3)。結(jié)果表明，家蠶與野桑蠶總體上分別聚為兩大類(lèi)群。與家蠶相比，野桑蠶具有顯著的遺傳多樣性，表現(xiàn)為野桑蠶進(jìn)化樹(shù)枝長(zhǎng)度存在顯著差異，而家蠶不同品種之間的進(jìn)化樹(shù)枝長(zhǎng)度較短。野桑蠶按照中國(guó)、日本各自聚為2大枝。6份安康野桑蠶總體上形成兩個(gè)聚類(lèi)，一是漢陰縣、嵐皋縣、漢濱區(qū)及akc20R2與山東青州在同一枝下聚類(lèi)，其中本次樣本與嵐皋縣、山東青州親緣關(guān)系較近，漢濱區(qū)和漢陰縣樣本與家蠶親緣關(guān)系最為接近，在進(jìn)化樹(shù)上分別聚類(lèi)為兩個(gè)小的亞群；二是來(lái)源于安康石泉縣的兩份野桑蠶與四川、江蘇、湖北等地的野桑蠶表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，聚集為一大類(lèi)群(圖3)。

圖2 克隆序列與石泉2份野桑蠶線粒體相應(yīng)序列的聯(lián)配比對(duì)

種類(lèi)序列數(shù)目計(jì)算長(zhǎng)度單倍型數(shù)多態(tài)位點(diǎn)數(shù)平均核苷酸差異單倍型多樣度核苷酸多樣度中國(guó)野桑蠶171873176725.5961.0000.01368日本野桑蠶2187321010.0001.0000.00534

表2野桑蠶COI序列中具有單體型特征的位點(diǎn)

圖3 野桑蠶線粒體COI序列的聚類(lèi)分析

Ws指野桑蠶(wild silkworm)。akHanyin指安康市漢陰縣；akNangao指安康市嵐皋縣；akHanbin指安康市漢濱區(qū)。實(shí)心圓指本研究中克隆所得序列，實(shí)心三角指文獻(xiàn)報(bào)道或GenBank中的野桑蠶序列。

3 討論

關(guān)于家蠶的起源，長(zhǎng)期以來(lái)有多起源假說(shuō)和單起源假說(shuō)的爭(zhēng)論[7]。基于線粒體的研究，魯成等推理出家蠶是從不同的地域和時(shí)期進(jìn)化獨(dú)立進(jìn)化而來(lái)[3, 9～14]。筆者研究克隆了一份安康野桑蠶長(zhǎng)度為1 873 bp的線粒體片段序列，序列比對(duì)表明其與石泉縣2份野桑蠶序列存在48處位點(diǎn)差異；聚類(lèi)分析表明該野桑蠶與與嵐皋縣、山東青州親緣關(guān)系較近，且與家蠶聚為大的類(lèi)群，顯示其與家蠶親緣關(guān)系較近；綜合與18份不同地域來(lái)源的野桑蠶、31份家蠶線粒體相應(yīng)序列的聚類(lèi)分析，表明6份安康野桑蠶可分為兩大類(lèi)，其一是石泉縣2份野桑蠶與湖南、四川、江蘇、湖北等地野桑蠶聚為一大類(lèi)群，與家蠶親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其二是包括本次研究在內(nèi)的4份安康野桑蠶及山東青州野桑蠶與家蠶聚為一大類(lèi)群，與家蠶親緣關(guān)系較近，顯示出秦巴地區(qū)野桑蠶復(fù)雜多樣的遺傳特性。