王 曄 李 航 湯 宇 單夢樂 張飛燕 孫立夫 張艷華

(紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，紹興 312000)

土壤是陸地生物賴以生存的基礎(chǔ)。近年來，工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和交通運輸導(dǎo)致土壤污染越來越嚴(yán)重。中國南方地區(qū)長期受到酸雨的影響，導(dǎo)致土壤的酸化，以及由此引發(fā)的金屬離子的活化，加大了生態(tài)系統(tǒng)自我修復(fù)的難度。由于重金屬不能被土壤微生物消解，只能在環(huán)境中遷移和轉(zhuǎn)化，當(dāng)積累到一定程度就會產(chǎn)生毒害，破壞土壤的理化性質(zhì)，進而通過食物鏈，危及生態(tài)系統(tǒng)安全和人類健康[1]。城市濕地的存在對凈化環(huán)境，減少重金屬的危害起到了一定的調(diào)節(jié)作用。菌根是植物根系與土壤真菌形成的互惠共生體，絕大多數(shù)的維管植物都能形成菌根[2]。菌根植物在污染土壤的修復(fù)中被認(rèn)為是具有積極作用的[3]。

具有外生菌根(ECM)的宿主植物經(jīng)常是我國亞熱帶森林中的主要建群種，如松科(Pinaceae)和殼斗科(Fagaceae)的植物[4]，杜鵑花類菌根(ERM)的宿主——杜鵑花科(Ericaceae)植物常常與優(yōu)勢種相伴而生，而禾本科(Poaceae)、菊科(Asteraceae)等植物是常見的林下、林緣、田間的主要草本植物，且常具有叢枝菌根(AM)結(jié)構(gòu)[5]。因不同類型植物在菌根結(jié)構(gòu)和真菌組成方面各有特點，對重金屬和有害金屬的毒害反應(yīng)和相應(yīng)的抵御機制也有不同[3,6～9]。本文以紹興市鏡湖城市濕地公園為研究樣地，以次生林下AM宿主植物黑麥草(LoliumperenneL.)、六月霜(MonochasmasauatieriFranch)和ERM宿主植物烏飯樹(VacciniumbracteatumThunb)為研究對象，分析這3種宿主植物根部真菌群落的組成和結(jié)構(gòu)，特別是其功能菌群的建立情況，及其與幾種金屬元素之間的相關(guān)關(guān)系，不同宿主植物對土壤金屬元素富集的能力進行比較，以期為城市濕地環(huán)境中植物菌根真菌群落組成和結(jié)構(gòu)的深入研究以及環(huán)境保護提供一定的參考。

1 研究方法

1.1 研究樣地的設(shè)置

在鏡湖城市濕地公園的梅山和人工綠化園區(qū)，根據(jù)植被分布的情況，合理布局取樣點。選擇具有代表性的30個以上的地段，采集土壤樣品進行重金屬種類分析和含量測定。AM植物黑麥草和六月霜，ERM植物烏飯樹，每種選擇6株以上的樣株。每各樣點距離在15 m以上。

1.2 樣品的采集

在次生林中，分別選取了自然生長的黑麥草、六月霜和烏飯樹各7、6和7個樣株，相同種類的兩個樣株距離15 m以上，共采集植物毛根樣品20份。在采集毛根的同時，也采集各樣株的根、莖、葉(黑麥草莖葉合一)共53個樣品。在人工園區(qū)和次生林下分別采集了(-5～-20 cm)10和24個土壤樣品。

1.3 毛根樣品的處理

將采集ERM和AM宿主的毛根，蒸餾水洗凈，用天根生化科技有限公司的新型植物基因組提取試劑盒進行DNA提取，PCR擴增，具體方法詳見Zhang等的研究[10]，電泳檢測擴增產(chǎn)物，并將確定有擴增產(chǎn)物的DNA樣品，低溫保存，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司(Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co.,Ltd)測序，選擇Illumina Miseq PE250平臺，引物為真菌特異性引物ITS1F-ITS2R，每樣品提供≥3萬條reads。

1.4 金屬元素含量的測定

精確稱取烘干、研磨和過篩后的根、莖、葉和土壤樣品各0.5 g，用硝酸—高氯酸和王水—高氯酸分別對植物組織和土壤進行消解，消解后的產(chǎn)物在比色管中加雙蒸水定容至10 mL，用美國利曼Prodigy XP型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-AES)測定樣品中的元素含量。選擇Al、Zn、Cu、Cr、K共5種元素進行檢測。

1.5 數(shù)據(jù)分析

金屬元素含量的ANOVA分析和多重比較等在SPSS22.0中進行，根部真菌群落，如種類組成、多樣性、主坐標(biāo)分析(PCoA)、典型相關(guān)分析(CCA)等及作圖均在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的云平臺上(r軟件包)進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 公園土壤中5種金屬元素含量的比較

為了了解JCWP土壤重金屬含量的現(xiàn)狀，在公園不同位置收集了34份土壤樣品，測量了Al、Cr、Cu、K、Zn元素在人工綠化園區(qū)和次生林土壤中的含量(表1)。

由表1可知，5種元素含量在兩種生境中都有極顯著差異(P≤0.01)，且這5種金屬元素含量均在人工綠化園區(qū)土壤中更高。分析原因可能是與人工園區(qū)相比，次生林下物種組成多樣，植被結(jié)構(gòu)復(fù)雜，多年生植物較豐富，能吸收更多重金屬及有害金屬，對土壤金屬的富集和轉(zhuǎn)移能力更強。總體上，公園內(nèi)次生林下重金屬污染程度不高。

表1 公園土壤中金屬元素含量的比較

注：**表示差異顯著(P≤0.01)，下表同。

Note:**showed significant difference(P≤0.01),the same as below.

表2 3種植物不同部位金屬元素含量一覽表

2.2 植物對金屬元素富集的比較

在植物物種之間和不同取樣部位之間的金屬元素含量進行統(tǒng)計(表2)。

每種金屬含量在3種植物相同部位間進行ANOVA分析，和LSD、S-N-K及Duncan多重比較。結(jié)果顯示：Al含量在植物種類之間有顯著差異(P<0.05)，烏飯樹富集更多的Al，與莖部相比更多地集中在根部和葉部。K、Cu、Zn、Cr含量在植物種類間都有極顯著差異(P<0.01)。六月霜作為一種中藥材對K、Cu元素的富集能力較強，且都在葉中最高，同時葉中Zn和Cr含量也極高。如果根據(jù)國家食品安全衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB2715-2016)規(guī)定，新鮮蔬菜中的Cr含量不得超過0.5 mg·kg-1的標(biāo)準(zhǔn)，按照這樣的標(biāo)準(zhǔn)，鏡湖濕地梅山上的六月霜是不適宜入藥的。黑麥草對Cr的富集能力也很強，且主要集中在根部。兩種AM菌根類型的草本植物生長狀態(tài)良好，對Cr的富集均高于ERM植物。在ERM的抗重金屬的諸多研究中更常見的是其對在Zn和Cu[11～12]、Cu和Ni[13]、As和Cu[3]、Pb和Cu[14]等污染的土壤中都表現(xiàn)出很強的抵抗力和進化適應(yīng)能力，及其在Al活躍的酸性土壤中出色的表現(xiàn)[3]，本研究結(jié)果也證明了烏飯樹這一酸性土壤中的常見伴生物種，對Al有很好的富集和耐受能力。作為菌根植物，它們對金屬元素的富集特點是否與其菌根真菌的作用有關(guān)？我們對自然分布在JCWP次生林下不同位置的樣株進行了根部真菌群落組成和結(jié)構(gòu)的分析。

2.3 3種植物根部真菌群落的組成和結(jié)構(gòu)

對黑麥草、六月霜和烏飯樹共20個樣本進行了高通量測序，分類學(xué)信息見表3。

表3 3種植物根部真菌的分類學(xué)信息一覽表

Table 3 Taxonomic information of fungi associated with roots of three plant species

植物名稱Plant name門Phylum綱Class目Order科Family屬GenusOTUs黑麥草L.perenne62357114187472六月霜M.sauatieri72258113176466烏飯樹V.bracteatum72557107165442

圖1 烏飯樹根部真菌群落組成(目水平)Fig.1 Fungal community composition in root of V.bracteatum(Order level)

據(jù)表3可知，3種植物根部的真菌屬于6個真菌門，分別是Ascomycota、Basidiomycota、Chytridiomycota、Glomeromycota、Zygomycota、unclassified_ Fungi(未分類真菌)。而六月霜和烏飯樹根部還有少量Rozellomycota。3種植物在各分類等級中的數(shù)目都大體相同或相近，且3種植物均以Ascomycota為優(yōu)勢真菌。Glomeromycota作為典型的AM真菌[5]在黑麥草和六月霜根部真菌群落中的占比很少，群落組成中雜菌多，功能菌少；而公認(rèn)的典型ERM真菌Ascomycota的Helotiales[7]和Oidiodendron的真菌[15]，以及Basidiomycota中的Sebacinales[16]在烏飯樹根部真菌群落中都出現(xiàn)，真菌群落中還有少量的ECM真菌，如Sclerodermataceae，Thelephoraceae。有趣的是在7個烏飯樹樣株根部群落中Helotiales和Sebacinales的占比有很大差別，除V1外，其他6個樣株中這兩個公認(rèn)的ERM真菌目有此消彼長的互補態(tài)勢如圖1，功能性菌群已經(jīng)建立，而且比重很高，可能較好地發(fā)揮ERM菌根在酸性土環(huán)境中營養(yǎng)吸收和抵抗重金屬等方面的作用[17]。

3種植物根部真菌共有和特有的OTUs見Venn圖2。從圖2中可知黑麥草、六月霜和烏飯樹的OTUs分別為466、472和442，其特有的OTUs分別為222、213和258，而三者共有的OTUs為87。其中AM菌根植物六月霜與黑麥草共有的OTUs為203，總體上根部真菌種類組成在物種級別上的差異是很大的，可能與植物物種之間親緣關(guān)系較遠有關(guān)。

圖2 3種植物根部真菌OTUs的組成 L.黑麥草；M.六月霜；V.烏飯樹Fig.2 Composition of OTUs from fungi associated with roots of three plants L.L.perenne; M.M.sauatieri; V.V.bracteatum

進一步對3種植物根部真菌群落進行PCoA排序，得到兩個主成分PC1和PC2其貢獻率分別為16.78%和12.73%(圖3)。從圖3可知，黑麥草、六月霜和烏飯樹根部真菌群落樣本之間的OTUs組成和結(jié)構(gòu)分化明顯，在PC1中ERM的烏飯樹和AM的六月霜和黑麥草有明顯區(qū)分，烏飯樹的根部真菌群落位于右側(cè)，而黑麥草和六月霜依次位于中部和左側(cè)，說明不同菌根類型差異還是明顯的；PC2中又將烏飯樹和六月霜與黑麥草明顯劃分為上下兩個半?yún)^(qū)，說明即使是相同的菌根類型，由于物種分類學(xué)關(guān)系較遠，其根部內(nèi)生菌的組成和結(jié)構(gòu)也有顯著分異。

圖3 3種植物根部真菌群落(OTUs水平)PCoA排序Fig.3 PCoA of OTUs from fungi associated with roots of three plants

圖4 各樣本(OTUs水平)Shannon指數(shù) L.黑麥草；M.六月霜；V.烏飯樹Fig.4 Shannon index of simples with OTUs level L.L.perenne; M.M.sauatieri; V.V.bracteatum

表4 3種植物根部真菌平均多樣性指數(shù)一覽表

Table 4 Averaged diversity index of fungi associated with roots of three plant species

植物名稱Plant nameShannonSimpsonAceChaoCoverage黑麥草L.perenne2.350.178142.50142.41.000六月霜M.sauatieri1.430.462169.45169.80.999烏飯樹V.bracteatum1.940.258110.80109.51.000

對3種植物根部真菌群落進行Alpha多樣性分析，比較各宿主根部真菌群落的平均豐度和多樣性指數(shù)(表4)。

測序深度指數(shù)Coverage(樣本文庫的覆蓋率)越高，表明樣本中序列被測出的概率越高，我們的樣本都在0.999以上。Chao和Ace是菌群豐度指數(shù)，其值越高表明豐度越高，Shannon和Simpson是菌群多樣性指數(shù)，前者值越高表明菌群多樣性越高，后者相反，值越低意味著菌群多樣性越高。從表4可知六月霜的真菌群落平均豐度最高，多樣性最低，而黑麥草多樣性最高，烏飯樹的豐度最低。圖4能更清楚地看到3種植物20個真菌群落樣本Shannon多樣性指數(shù)的具體表現(xiàn)。

2.4 3種植物根部真菌群落和元素含量之間的關(guān)系

為了進一步說明根部真菌群落與所測環(huán)境土壤中金屬元素含量之間的關(guān)系，我們對所得數(shù)據(jù)進行了典型相關(guān)分析(Canonical Correlation Analysis，CCA)，由于很多OTUs不能鑒定到更低的單位，我們以目水平為基礎(chǔ)建立物種、真菌樣本和土壤環(huán)境因子中5種元素含量之間的CCA分析(圖5)。箭頭表示元素種類，箭頭的長短可以代表元素對于物種數(shù)據(jù)的影響程度，箭頭間的夾角代表正、負(fù)相關(guān)性(銳角為正相關(guān)；鈍角為負(fù)相關(guān)；直角為無相關(guān)性)，角度越小相關(guān)性越密切。由圖5可知，土壤中Al、Cu和K對真菌目水平的影響程度較高，Zn和Cr相對較弱。除一個樣本外，烏飯樹的其余6個真菌群落樣本均與Al、K、Cu和Cr呈正相關(guān)關(guān)系，與Zn不相關(guān)；黑麥草中有5個樣本與Zn正相關(guān)，與其他4種元素幾乎都不相關(guān)。六月霜多數(shù)樣本與Al、Zn和Cr呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

對3種植物根部目水平的真菌與土壤中的金屬元素進行相關(guān)性分析，并將具有顯著影響的和兩個公認(rèn)的ERM真菌目的Pearson相關(guān)性系數(shù)列于表5中。從表5中可知，樣本中與Cr有顯著正相關(guān)的有兩個真菌目，有顯著負(fù)相關(guān)的只有Atractiellales。與Zn和K有顯著正相關(guān)的分別有3個真菌目，而與Al均無顯著相關(guān)。Helotiales和Sebacinales作為典型常見的ERM真菌，與所測各元素均無顯著相關(guān)，也進一步說明了它們對環(huán)境因子不敏感，在南北半球不同生態(tài)系統(tǒng)中都有廣泛分布的事實[18～23]。而黑麥草和六月霜在AM功能菌欠缺的情況下，植物本身仍然具有較強的環(huán)境適應(yīng)能力。

圖5 環(huán)境因子、真菌群落和樣本(目水平)的CCA排序 L.黑麥草；M.六月霜；V.烏飯樹Fig.5 CCA ordination of environmental factors, fungal communities and samples(order level L.L.perenne; M.M.sauatieri; V.V.bracteatum

表5 3種植物根部真菌(目水平)與土壤中五個金屬元素Pearson相關(guān)性系數(shù)

Table 5 Pearson correlation coefficients between root fungi (order level) of three plants and five metal elements in soil

目orderAlCrCuKZnArchaeorhizomycetales0.1310.1450.083 0.473?-0.246 Atractiellales-0.443-0.460?-0.557?-0.352-0.340Capnodiales0.1590.447?0.3610.3570.266Cystofilobasidiales0.2610.2460.199-0.1410.649??Eurotiales0.1750.0430.1960.529?-0.228Georgefischeriales0.0960.0690.162-0.2320.621??Helotiales0.4020.2070.3550.2480.194Hypocreales0.2640.565??0.1510.1070.358Microascales0.1700.1490.0560.484?-0.208Mortierellales0.0580.0190.149-0.2340.590??Saccharomycetales0.1630.1730.0930.528?-0.242Sebacinales0.078-0.0080.0990.409-0.236Sporidiobolales0.4240.484?0.1590.0680.278

*0.01

3 結(jié)論

在浙江鏡湖城市濕地公園人工綠化園區(qū)比在園內(nèi)梅山次生林土壤中Al、Cr、Cu、K和Zn的含量更高，次生林土壤狀態(tài)良好。對次生林中自然生長分布的3種菌根植物進行金屬元素富集能力的比較，發(fā)現(xiàn)ERM宿主植物烏飯樹能富集更多的Al，而AM宿主植物黑麥草和六月霜Cr的富集能力都更強，說明不同菌根類型宿主植物對金屬元素富集能力有較大差異。3種植物根部真菌群落中都表現(xiàn)出Ascomycota占優(yōu)勢，而在烏飯樹毛根中Basidiomycota也是真菌群落中的主要組成部分。黑麥草和六月霜根部群落中AM真菌組分很少，功能菌群尚未建立，而烏飯樹根部公認(rèn)的ERM真菌——Helotiales和Sebacinales在群落結(jié)構(gòu)中占較大優(yōu)勢，且出現(xiàn)互補態(tài)勢。CCA分析烏飯樹根部真菌群落樣本與Zn以外的土壤其他4種金屬元素含量都呈正相關(guān)關(guān)系，但是Helotiales和Sebacinales與5種元素之間相關(guān)性均不顯著，進一步說明這兩個公認(rèn)的ERM真菌目與杜鵑花科宿主一起可以在全球多種生境中廣泛分布的事實。

致謝野外樣品采集和實驗過程中得到了湯訪評、韓麗和金葉飛老師的大力支持，特此致謝。