張娟 李文苑 高利娥 馬瑩 丁梓桐 李福厚 郭旭生

蘭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院益生菌與生物飼料研究中心，甘肅省，蘭州市，730000

前言

現(xiàn)代生活中不健康的生活習(xí)慣和高糖高脂飲食攝入，會(huì)導(dǎo)致人體血清中膽固醇含量過(guò)高，從而引發(fā)多種疾病，例如心血管疾病，癌癥和非酒精性脂肪肝等[1-3]，這些疾病威脅著人類(lèi)的健康與生命。研究發(fā)現(xiàn)，一些乳酸菌具有較強(qiáng)的降膽固醇能力，服用乳酸菌或者乳酸菌發(fā)酵乳制品可以有效地降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人體血清中的膽固醇含量[4-9]，因此近幾年對(duì)乳酸菌降膽固醇活性的研究備受關(guān)注。目前已知乳酸菌降膽固醇機(jī)理，主要是通過(guò)（1）菌體吸收或菌膜吸附膽固醇；（2）分泌膽鹽水解酶，將結(jié)合態(tài)膽汁酸水解為游離的膽酸，與膽固醇共沉淀；（3）膽鹽水解酶將結(jié)合態(tài)膽汁酸水解為游離的膽酸和膽鹽，游離態(tài)的膽酸不利于腸道吸收，繼而被排出體外，宿主需要通過(guò)膽固醇合成新的膽酸維持正常代謝，以此來(lái)降低血清中的膽固醇含量[10-12]。

青藏高原地理環(huán)境特殊，這里的傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛奶含有豐富的乳酸菌資源[13]，由于牦牛奶中脂肪濃度相比普通牛奶更高，所以乳酸菌在傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛奶的高脂肪環(huán)境中長(zhǎng)期適應(yīng)，賦予它們天然的膽固醇降低能力[14，15]。本課題組在青藏高原不同地區(qū)采集傳統(tǒng)發(fā)酵的牦牛酸奶樣品，經(jīng)過(guò)分離純化后得到720株乳酸菌，首先對(duì)這些乳酸菌進(jìn)行體外降脂溶性膽固醇能力試驗(yàn)，再通過(guò)穩(wěn)定性較好的水溶性膽固醇進(jìn)行復(fù)篩，意在篩選出高降膽固醇特性的優(yōu)良菌株，為后續(xù)乳酸菌在降膽固醇動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和機(jī)制的研究中提供有力的依據(jù)。

1.實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

分別在天祝、那曲、若爾蓋、玉樹(shù)、紅原和瑪曲不同牧區(qū)的牧民家中采集傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶樣品202份。

1.2 方法

1.2.1 酸奶樣品采集及處理

將牧民家采集的傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶樣品分別裝入滅菌后的凍存管中，快速送回實(shí)驗(yàn)室凍存。使用滅菌生理鹽水稀釋酸奶樣品，取適當(dāng)稀釋度樣品0.1 mL于MRS、M17和SL培養(yǎng)基中，涂布均勻，37℃厭氧培養(yǎng)48h，肉眼觀(guān)察并記錄培養(yǎng)皿中的菌落形態(tài)特征，挑取不同大小、顏色、光澤、邊緣的菌落于MRS液體培養(yǎng)基中。

1.2.2 菌種分離純化

將從樣品中分離的乳酸菌活化3-4代，使用接種環(huán)蘸取菌液在MRS平板培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，培養(yǎng)48 h后挑取優(yōu)勢(shì)菌落，重復(fù)多次直至平板上的菌落形態(tài)一致，根據(jù)菌落的不同表觀(guān)形態(tài)，確定為分離純化后的菌株。再挑取單個(gè)菌落于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3代，加入甘油放入-80℃冰箱保存。

1.2.3 過(guò)氧化氫酶檢測(cè)

菌株在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-3代，用接種環(huán)蘸取菌液，在PYG斜面培養(yǎng)基劃線(xiàn)接種，37℃恒溫培養(yǎng)48 h后，向菌落滴加1-2滴3-15%（v/v）的過(guò)氧化氫，2-3分鐘后觀(guān)察是否有氣泡。有氣泡產(chǎn)生為陽(yáng)性菌株，沒(méi)有氣泡產(chǎn)生則為陰性菌株。

1.2.4 乳酸菌降解脂溶性膽固醇降的篩選

準(zhǔn)確稱(chēng)取100mg的膽固醇和220mg的卵磷脂于100mL的錐形瓶中（膽固醇與卵磷脂的摩爾比為0.9：1.0），加入5mL三氯甲烷溶劑溶解。通入N2吹干溶劑，加100mL 0.4 M的蔗糖溶液。通入N2，并在冰浴條件下超聲波溶解15min，暫停5 min散熱，循環(huán)三至四次，待充分溶解形成均勻膠體。4℃，38000g，離心20min取上清，得到卵磷脂-膽固醇膠束溶液，添加在液體MRS 培養(yǎng)基中（10%的卵磷脂-膽固醇膠束溶液于MRS液體培養(yǎng)基），即為MRS-Thio培養(yǎng)基。

調(diào)整待測(cè)菌的數(shù)量至1.0×109 cfu/mL，按1%（v/v）的接種量接種于含0.3%的牛膽粉的MRS-Thio培養(yǎng)基中，搖勻后立即取樣1 mL，10000rpm/min，離心2min，取上清液0.5 mL，采用鄰苯二甲醛法測(cè)定接種后培養(yǎng)液中的膽固醇含量。剩余的發(fā)酵液于37℃靜置培養(yǎng)48 h，對(duì)照為不加菌液的含有0.3%的牛膽粉的MRS-Thio培養(yǎng)基。采用鄰苯二甲醛法測(cè)定膽固醇的含量[11]，步驟有所改動(dòng)，根據(jù)繪制的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出膽固醇的含量。

A、B分別表示接種后培養(yǎng)液中的膽固醇含量和培養(yǎng)48 h后培養(yǎng)液中的膽固醇含量

1.2.5 乳酸菌降解水溶性膽固醇降的篩選

準(zhǔn)備100μg/ml水溶性膽固醇溶液，在超凈工作臺(tái)用濾膜過(guò)濾除菌。取之前初篩出的72株乳酸菌解凍，活化3-4代后，調(diào)整菌的數(shù)量至1.0×109 cfu/mL，1%（v/v）的接種量于含0.3%牛膽粉的含水溶性膽固醇的MRS-Thio培養(yǎng)基中。水溶性膽固醇的添加量為100μL/mL?？瞻讓?duì)照為不添加菌液的MRS-Thio培養(yǎng)基。取樣1mL，10000 rpm/min，2min，取上清液0.5mL，采用鄰苯二甲醛法測(cè)定接種后培養(yǎng)液中的膽固醇含量[16-18]。剩余的發(fā)酵液于37℃靜置培養(yǎng)24h，鄰苯二甲醛法具體測(cè)定膽固醇含量。膽固醇降解率與卵磷脂-膽固醇膠束法的膽固醇降解率計(jì)算方法一致，但B表示培養(yǎng)24h后培養(yǎng)液中的膽固醇含量。

1.2.6 16SrDNA分子生物學(xué)鑒定菌種信息

參照試劑盒的方法，提取乳酸菌總DNA，使用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析后，送至上海美吉生物DNA測(cè)序。將得到的菌株16SrDNA基因序列輸入NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)同源性來(lái)確定菌株的種屬。對(duì)沒(méi)有鑒定出的乳酸菌進(jìn)行菌種特異性引物PCR[19]，特異性引物由生工合成。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

繪圖使用Sigma Plot 17.0，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同組間差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌分離純化結(jié)果

從青藏高原6個(gè)地區(qū)（那曲、瑪曲、紅原、玉樹(shù)、天祝和若爾蓋）采集202份傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶。通過(guò)MRS、SL和M17選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)分離純化，再經(jīng)過(guò)氧化氫酶篩選陰性菌，如表1所示，得到720株乳酸菌。

表1 青藏高原不同地區(qū)牦牛酸奶分離的乳酸菌數(shù)量

2.2 乳酸菌對(duì)脂溶性膽固醇的清除率

如圖1所示，720株乳酸菌均具有一定脂溶性膽固醇降解能力。降解率在80%以上的乳酸菌菌株共有12株，約占所有菌株的1.7%，其中一株BX39的膽固醇降解率高達(dá)90.05%。分離的菌株中有32株菌降解率為70%-80%，約占所有菌株的4.5%。脂溶性膽固醇降解率在60%-70%之間的菌株有49株，約占所有菌株的6.8%。在720株乳酸菌中，降解率在30%以下的菌株有393株，約占所有菌株的54.6%。脂溶性膽固醇降解率在68%以上的菌株，共有52株，具體降解率如表2所示。

圖1 720株乳酸菌脂溶性膽固醇降解率分布情況

表2 720株乳酸菌降解脂溶性膽固醇能力，其中降解能力＞ 68%的52株

如表3所示，這6個(gè)不同地區(qū)的乳酸菌對(duì)脂溶性膽固醇降解率存在差異，若爾蓋地區(qū)的乳酸菌降解率最高，為45.42%，并與其他地區(qū)都存在顯著性差異；那曲地區(qū)的降解率次之，為37.73%，與其他五個(gè)地區(qū)的乳酸菌在降解脂溶性膽固醇方面也存在顯著性差異；瑪曲和天祝地區(qū)在降解率差異不顯著，但與其他四個(gè)地區(qū)存在顯著性差異；紅原和玉樹(shù)地區(qū)的乳酸菌降解率較低，且這兩個(gè)地區(qū)沒(méi)有顯著性差異。結(jié)果說(shuō)明地理位置和環(huán)境對(duì)乳酸菌的降解能力會(huì)有一定的影響。

表3 不同地區(qū)乳酸菌對(duì)脂溶性膽固醇的降解率的差異（±SD）

2.3 乳酸菌對(duì)水溶性膽固醇的清除率

挑選初篩時(shí)測(cè)定出的降解率在68%以上的52株乳酸菌，以及降解率在60%以下的20株乳酸菌作為比較，驗(yàn)證復(fù)篩結(jié)果的準(zhǔn)確性，共計(jì)72株，測(cè)定菌株在含水溶性膽固醇培養(yǎng)液中的膽固醇降解率。72株乳酸菌的水溶性膽固醇降解率如圖2及表4所示，在含水溶性膽固醇的培養(yǎng)液中，乳酸菌的降解率都很高，其中一株BT18的降解率達(dá)到了96.26%，在90%-95%之間的乳酸菌株達(dá)到了27株，約占72株乳酸菌的37.5%；降解率在80-90%之間的菌株達(dá)到了30株，約占總菌株的41.6%；降解率在68-80%之間的菌株共5株，約占總菌株的6.8%；50%以下的有9株乳酸菌，約占總菌株的12.5%。部分乳酸菌的降解率有一定幅度的變化，但是整體上初篩高降解率的乳酸菌，復(fù)篩時(shí)仍然保持一定高降解率，而且水溶性膽固醇的方法更加穩(wěn)定。

圖2 72株乳酸菌對(duì)水溶性膽固醇降解率的分布情況

表4 72株乳酸菌水溶性膽固醇降解率

2.4 乳酸菌16S rDNA的鑒定結(jié)果

如表6所示，通過(guò)16SrDNA基因測(cè)序及序列分析比對(duì)，以及菌種特異性PCR檢測(cè)，72株乳酸菌株中共有2個(gè)屬，分別是乳桿菌屬（Lactobacillus）和片球菌屬（Pediococcus）。乳桿菌屬共68株，包括3個(gè)種，分別為羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。 片球菌屬共4株，都為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。72株乳酸菌株中羅伊氏乳桿菌約占88.88%，數(shù)量最多，這可能由于挑選菌株的時(shí)候，羅伊氏乳桿菌為培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)菌株。

表6 72株乳酸菌16S rDNA基因序列鑒定結(jié)果

3.討論

本課題從青藏高原6個(gè)地區(qū)采集202份牦牛酸奶樣品，經(jīng)過(guò)MRS、SL和M17的選擇性培養(yǎng)基分離純化，過(guò)氧化氫篩選得到720株乳酸菌，篩選和初步了解乳酸菌的降解特性，將對(duì)今后的實(shí)驗(yàn)具有重大的意義。

膽固醇可以和強(qiáng)堿氫氧化鉀發(fā)生皂化反應(yīng)，加入乙醇是為了反應(yīng)更充分。產(chǎn)生的酯類(lèi)物質(zhì)即固醇類(lèi)化合物，可被正己烷萃取，與酸作用時(shí)，發(fā)生聚合反應(yīng)，再和顯色劑鄰苯二甲醛結(jié)合，產(chǎn)生紫紅色物質(zhì)。乳酸菌降解脂溶性膽固醇試驗(yàn)中，720株乳酸菌都有一定的降膽固醇能力，不同地區(qū)的乳酸菌對(duì)膽固醇降解率存在差異，研究發(fā)現(xiàn)若爾蓋地區(qū)的乳酸菌對(duì)膽固醇降解率均值最高，為45.42%，這說(shuō)明來(lái)自青藏高原牦牛酸奶中的乳酸菌的膽固醇降解能力，有可能會(huì)受到地理環(huán)境的影響，具體原因尚未闡明。

復(fù)篩結(jié)果顯示72株乳酸菌對(duì)水溶性膽固醇的降解率都很高，初篩時(shí)降解率偏高的菌株，復(fù)篩時(shí)降解率會(huì)增加或者降低；但是，挑選初篩時(shí)膽固醇降解率較低的菌株，其對(duì)水溶性膽固醇的降解率也較低。對(duì)比兩種方法下測(cè)定的膽固醇降解率，水溶性膽固醇的降解率更具穩(wěn)定性，重復(fù)之間的差異更小。

通過(guò)16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，分析比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，這72株乳酸菌中有64株羅伊氏乳桿菌、4株乳酸片球菌、3株瑞士乳桿菌和1株植物乳桿菌。羅伊氏乳桿菌的數(shù)量占比很大，且具有很高的膽固醇降解特性，具有較好的研究?jī)r(jià)值。

綜上所述，青藏高原牦牛酸奶中乳酸菌的膽固醇降解率最高的為羅伊氏乳桿菌BT18，膽固醇降解率高達(dá)96.26%。本實(shí)驗(yàn)只是對(duì)青藏高原牦牛酸奶中具有降膽固醇特性的乳酸菌進(jìn)行初步篩選，進(jìn)一步了解乳酸菌的降解能力還需要進(jìn)行大量體外益生特性研究，以及動(dòng)物和臨床的實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證這些菌株的降膽固醇功效。此外，對(duì)乳酸菌的降膽固醇作用機(jī)理和代謝途徑的探究，也是今后對(duì)青藏高原傳統(tǒng)牦牛酸奶中乳酸菌的研究重點(diǎn)。