張廷貴 鄧其馨 林艷 周培琛 張鼎方 劉江生 劉澤春 許寒春

摘要：建立同時測定煙草中肌醇和奎尼酸的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）方法。采用0.1mol/L的乙酸鉸水溶液對煙末進行超聲提取后，經(jīng)0.22μm水相濾膜過濾后直接進行LC-MS/MS分析。結(jié)果表明：肌醇在0.11～25mg/g和奎尼酸在0.18～25mg/g范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)均≥0.9990。肌醇的回收率在95.9%～98.6%之間，相對標準偏差（RSD）小于1.9%（n=6）;奎尼酸的回收率在95.2%～97.4%之間，相對標準偏差（RSD）小于2.1%（n=6）.肌醇的方法檢出限（LOD）為0.035mg/g，定量限（LOQ）為0.11mg/g;奎尼酸的方法檢出限（LOD）為0.055mg/g，定量限（LOQ）為0.18mg/g。該方法準確、靈敏，適合用于煙草中肌醇和奎尼酸的測定。

關(guān)鍵詞：液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜;煙草;肌醇;奎尼酸

中圖分類號：O657.63;TS411 文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2019）07-0061-05

收稿日期：2018-10-21;收到修改稿日期：2018-11-26

基金項目：中國科協(xié)青年人才托舉工程CAST（2016QNRC001）

作者簡介：張廷貴（1985-），男，福建龍巖市人，工程師，主要從事煙草化學(xué)研究。

通信作者：鄧其馨（1984-），男，福建三明市人，高級工程師，碩士，主要從事煙草化學(xué)研究。

0 引言

肌醇和奎尼酸是廣泛存在于中草藥和煙草等植物中的天然含氧化合物[1]。肌醇是一種水溶性維生素，是動物、微生物的生長因子，其分子式為C₆H₁₂O₆，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為1，2，3，4，5，6-環(huán)己六醇[2]?？崴崾侵参镌谟醒鹾粑^程中，經(jīng)莽草酸途徑形成的一種環(huán)狀多羥基具有光學(xué)活性的化合物，其分子式為C₆H₇（OH）₄COOH，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為1，3，4，5-四羥基環(huán)己烷-1-羧酸[3]。據(jù)報道肌醇和奎尼酸的含量與煙草品質(zhì)和吃味密切相關(guān)，并且與主流煙氣中的苯酚含量具有顯著的相關(guān)性[4]。肌醇的檢測方法有微生物法[5]、高碘酸鉀氧化法[6]高效液相色譜法[7]、氣相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法[8-11]和液相色譜質(zhì)譜法[12-14]等。其中微生物法前處理過程復(fù)雜，高碘酸鉀氧化法誤差較大，高效液相色譜法對于成分復(fù)雜樣品分離效果差，而液相色譜質(zhì)譜法靈敏度高，適用于多種基質(zhì)中肌醇的檢測[15]。劉澤春等[16]利用高效液相結(jié)合二極管陣列檢測器測定了煙用香精香料中的奎尼酸，王有志等[17]利用高效液相色譜一電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法測定了雙黃連粉針劑中的奎尼酸。由于奎尼酸的最大紫外吸收在201nm且吸收很弱，因此HPLC/UV法不能檢測到奎尼酸，而液相色譜質(zhì)譜法選擇性好、靈敏度高能很好的解決奎尼酸的檢測問題。目前未見對煙草中奎尼酸檢測方法報道。本文建立了同時測定肌醇和奎尼酸的液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MSIMS）法，為煙草中肌醇和奎尼酸的分析測定和配方研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

肌醇（純度≥99%）、奎尼酸（純度≥98%）、乙酸銨（純度≥98%）、酯酸（色譜純）、甲醇（色譜純），購自百靈威科技有限公司。

Agilent 1290高效液相色譜儀（美國Agilent公司）;三重四級桿質(zhì)譜儀QTRAP 5500（美國ABSCIEX公司）;AG104電子天平（感量：0.0001g，瑞士Mettler Toledo公司）;GFL3017型臺式旋轉(zhuǎn)振蕩器（德國Gesellschaft公司）;Human型超純水系統(tǒng)（北京普析通用儀器有限責任公司）0.22μm水相濾膜（美國Dionex公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準工作溶液配制

分別準確稱取0.1g肌醇和奎尼酸于100mL棕色容量瓶中，用0.1mol/L乙酸銨水溶液溶解和定容，配制成1mg/mL標準儲備液。用0.1mol/L乙酸銨水溶液將標準貯備液稀釋為1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、30.0μg/mL、50.0μg/mL正系列濃度的肌醇和奎尼酸混合標準工作溶液。

1.2.2 樣品溶液配制

準確稱取0.1g煙末樣品，置于150mL磨口三角瓶中，準確加入50mL 0.1mol/L的乙酸銨水溶液，超聲振蕩30min，經(jīng)0.22μm水相濾膜過濾后直接進樣分析。

LC-MS/MS條件為：色譜柱：菲羅門Luna 5uC18色譜柱（150.0mm×3.9mm，5μm）;流動相：A.甲醇，B.0.1%酯酸水溶液;等度洗脫：0～5min，1%A;流量：0.8mL/min;柱溫：40℃;進樣體積：5μL;離子源：電噴霧電離源（ESI）;掃描方式：負離子掃描;檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）;電噴霧電壓：-4500V;離子源溫度：550℃;輔助氣（氮氣）Gas1壓力：413.70kPa（60psi）;輔助氣（氮氣）Gas2壓力：344.75kPa（50psi）;去簇電壓（DP）：-40V;定量離子對（m/z）和碰撞能見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

肌醇和奎尼酸的總離子流圖（TIC）如圖1所示，由圖1可知，采用Luna 5u C18色譜柱對肌醇和奎尼酸進行分離時，分離度>2，色譜峰的峰形較好，且在實際樣品的檢測中沒有出現(xiàn)雜峰干擾。此外，本文比較了純水和0.1%酯酸作為流動相。采用純水作為流動相時，奎尼酸不出峰，且肌醇的峰強度較低，而采用0.1%酯酸作為流動相時，色譜峰型較好，響應(yīng)值較高。因此采用0.1%酯酸作為流動相。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

取一定量肌醇和奎尼酸的混合標準儲備液，稀釋100倍，得到肌醇和奎尼酸濃度均為10μg/n止的混合標準溶液。采用流動注射法對該溶液直接進行MS分析，根據(jù)肌醇和奎尼酸的分子結(jié)構(gòu)特征，選擇電噴霧（ESI）離子源，在負離子模式下分別對肌醇和奎尼酸進行一級質(zhì)譜分析，得到肌醇和奎尼酸的分子離子峰，選擇合適的分子離子峰進行二級質(zhì)譜碎片分析，得到子離子信息。結(jié)果見圖2，圖3。然后，以肌醇為目標物，固定其他參數(shù)，調(diào)節(jié)電噴霧電壓為-3500V，-4000V，-4500V，響應(yīng)豐度分別為1.69×10⁵，1.75×10⁵，1.83×10⁵，因此選擇電噴霧電壓為-500V，調(diào)節(jié)離子源溫度為500℃，550℃，600℃，響應(yīng)豐度分別為1.77×10⁵，1.83×10⁵，1.80×10⁵，因此選擇離子源溫度為550℃。自動調(diào)節(jié)去簇電壓從-10V到-70V，步長為5V，響應(yīng)豐度為-40V時達到最大?？崴岬膮?shù)設(shè)定與肌醇一致。固定上述參數(shù)分別自動調(diào)節(jié)肌醇和奎尼酸的碰撞能，從-10V到-70V，步長為5V，響應(yīng)豐度分別在-25V和-20V時達到最大。因此確定上述各參數(shù)。

2.3 前處理條件的確定

不同濃度乙酸銨水溶液萃取煙末樣品的結(jié)果見圖4。用純水作為萃取溶劑的萃取效率較低，肌醇和奎尼酸的效率（以峰面積表示）約分別為0.09mol/L乙酸按體系效率的50%和45%;當乙酸錢濃度升高至0.09mol/L、0.12mol/L和0.15mol/L時，煙草粉末提取液中肌醇和奎尼酸的濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），因此選擇0.09mol/L乙酸銨為萃取溶劑。

2.4 工作曲線

按照1.2節(jié)所述條件對樣品進行LC-MSIMS分析，并以肌醇和奎尼酸的峰面積對其濃度值進行線性回歸分析。空白樣品連續(xù)測量11次，計算標準偏差，將3倍標準偏差記為方法的檢出限，將10倍標準偏差記為方法的定量限，見表2。可見本方法肌醇在0.11～25mg/g和奎尼酸在0.18～25mg/g檢測范圍內(nèi)線性良好，檢出限和定量限能滿足測定要求。

2.5 精密度和穩(wěn)定性

精密度：在相同條件下，對同一樣品平行測定6次。樣品的肌醇含量結(jié)果為9.0，9.1，9.3，9.2，9.1，9.3mg/g，相對標準偏差（RSD）為1.32%;奎尼酸含量結(jié)果為5.1，5.1，5.3，5.2，5.2，5.4mg/g，相對標準偏差（RSD）為2.24%，表明方法的精密度高。

穩(wěn)定性：在相同條件下，對同一樣品的待測液，在室溫分別存放0，12，24h后進行測定，結(jié)果見圖5。由圖5可見，樣品按照上述方法處理后，待測液中的肌醇和奎尼酸含量在24 h內(nèi)穩(wěn)定。2.6回收率

對同一煙末樣品，在固體煙葉粉末中分別添加5.0mg/g、10.0mg/g、20.0mg/g 3種濃度水平的肌醇標樣和1.0mg/g、5.0mg/g、10.0mg/g 3種濃度水平的奎尼酸標樣，按照1.2節(jié)的方法對3個濃度水皮的樣品重復(fù)測定6次，如表3所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌醇回收率在95.9%～98.6%之間，相對標準偏差（RSD）在1.4%～1.9%之間;奎尼酸回收率在95.2%～97.4%之間，相對標準偏差（RSD）在1.7%～2.1%之間?？梢姺椒ǖ幕厥章屎椭貜?fù)性較好，可以滿足樣品的檢測要求。

2.7 實際樣品分析結(jié)果

本文采用建立的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定了不同產(chǎn)區(qū)不同部位單料煙肌醇和奎尼酸的含量。結(jié)果（見表4）表明：1）肌醇的含量在6.0～10.9mg/g之間，奎尼酸的含量在1.1～6.7mg/g之間。肌醇的含量高于奎尼酸的含量。2）1^#、3^#產(chǎn)地煙葉中肌醇和奎尼酸的含量上部煙高于下部煙，2^#產(chǎn)地煙葉中肌醇和奎尼酸的含量下部煙高于上部煙。

3 結(jié)束語

本研究主要考察了不同類型和濃度萃取液對煙草中肌醇和奎尼酸的提取效率，優(yōu)化液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法中的色譜參數(shù)和質(zhì)譜參數(shù)，建立了同時測定肌醇和奎尼酸的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法。實際樣品測試結(jié)果表明該方法前處理簡便，靈敏度和準確性高，重復(fù)性好，分析速度快，大大提高了檢測效率，適合用于煙草中肌醇和奎尼酸含量的測定。

參考文獻

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