抗氧化劑引發(fā)對(duì)無(wú)芒雀麥老化種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)的影響

孫銘，王思琪，艾爾肯·達(dá)吾提，毛培勝*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，草業(yè)科學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.新疆草原總站，新疆 烏魯木齊 830049)

種子是植物遺傳資源保存和種質(zhì)創(chuàng)新的基礎(chǔ)[1]。種子在生理成熟后干燥的狀態(tài)下可維持較長(zhǎng)時(shí)間的活力，但即使在良好的人為管理?xiàng)l件下貯藏也不可避免地要經(jīng)歷老化過(guò)程，在該過(guò)程中種子生存和萌發(fā)必需的成分被逐漸破壞，使其活力逐漸喪失并最終死亡[2-4]，因此種子老化的研究顯得尤為重要。種子在老化過(guò)程中會(huì)造成膜系統(tǒng)受損，酶活性普遍降低，遺傳物質(zhì)完整性下降，萌發(fā)及生長(zhǎng)減緩，發(fā)芽能力喪失等現(xiàn)象，表現(xiàn)為發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)降低，幼芽和幼根生長(zhǎng)受到抑制[5-6]。目前認(rèn)為活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生與消耗失衡是造成種子老化的關(guān)鍵[7]，因此ROS清除劑的研究對(duì)種子的老化修復(fù)尤為重要。

抗氧化劑是維持種子生命力的重要活性物質(zhì)，添加適當(dāng)?shù)耐庠纯寡趸瘎?，可以與種子內(nèi)部的活性物質(zhì)共同完成ROS的清除，進(jìn)而延緩或者修復(fù)種子的損傷[7]。抗壞血酸(ascorbic acid，AsA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)是抗壞血酸谷胱甘肽循環(huán)中兩種重要的抗氧化物質(zhì)，褪黑素(melatonin，MT)則是目前已知的清除能力最強(qiáng)的自由基清除劑[8]，它們?cè)谇宄参矬w內(nèi)過(guò)量的ROS方面具有重要的作用。目前，這些抗氧化劑在種子生理方面已經(jīng)有初步研究，主要集中在正常種子萌發(fā)及其抗逆生理方面。通過(guò)AsA處理鹽[9-10]、重金屬[11]、低溫[12]和高溫[13]等脅迫下的種子，發(fā)現(xiàn)AsA可以緩解脅迫對(duì)種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的抑制作用；MT同樣對(duì)鹽脅迫[14]、高溫處理[15]等種子的萌發(fā)具有促進(jìn)作用。相比而言，利用GSH外源添加研究種子生理的較少，如其對(duì)種子膜脂過(guò)氧化程度的影響[16]和重金屬離子毒害的緩解[17]等。但在抗氧化劑的研究上，尤其是通過(guò)引發(fā)技術(shù)對(duì)種子老化及活力修復(fù)的研究較少。然而引發(fā)處理被認(rèn)為是提高種子活力的有效手段，可以改善種苗的整齊度和出苗率，并增加種子和種苗的抗逆性[18]。本試驗(yàn)以無(wú)芒雀麥(Bromusinermis)種子為材料，利用AsA、GSH和MT溶液進(jìn)行引發(fā)處理，探討其對(duì)老化種子的發(fā)芽、幼苗生長(zhǎng)及抗氧化酶活性的影響，以期為緩解種子的老化提供理論參考，對(duì)草牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的無(wú)芒雀麥種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草種子實(shí)驗(yàn)室提供，2016年秋季收獲于河北省承德市國(guó)營(yíng)魚兒山牧場(chǎng)，試驗(yàn)于2017年5-12月進(jìn)行。種子基本信息見表1。

表1 無(wú)芒雀麥種子基本信息Table 1 Basic information of smooth bromegrass seeds (%)

參照國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)種子檢驗(yàn)規(guī)程(International Seed Testing Association，ISTA，2016)[19]測(cè)定種子含水量。稱取潔凈的無(wú)芒雀麥種子約4.5 g放入樣品盒后稱重(精確到0.001 g)，設(shè)置2次重復(fù)。將樣品放于烘箱中在130～133 ℃下烘干1 h，然后蓋好樣品盒蓋在干燥器中冷卻45 min后稱重。種子含水量計(jì)算公式為：種子含水量(%)=(M2-M3)/(M2-M1)×100%，式中：M1為樣品盒和蓋的重量(g)，M2為樣品盒、蓋及樣品的烘干前重量(g)，M3為樣品盒、蓋及樣品的烘干后重量(g)。

供試種子的初始含水量為10.6%，目標(biāo)含水量為10.0%，需將其含水量調(diào)低。首先稱取一定量的種子W0，計(jì)算出目標(biāo)含水量時(shí)種子的質(zhì)量，計(jì)算公式為：目標(biāo)含水量時(shí)種子的質(zhì)量(g)=[(100-MC0)/(100-MCr)]×W0，式中MC0為初始含水量(%)，MCr為需達(dá)到的含水量(%)，W0為初始種子質(zhì)量(g)。將這些種子置于0.075 mm篩中室溫干燥，并頻繁稱量其重量，達(dá)到目標(biāo)含水量時(shí)立即將種子密封于鋁箔袋中。

將調(diào)整好含水量的無(wú)芒雀麥種子3 g密封于10.0 cm×14.8 cm的鋁箔袋中，在45 ℃恒溫水浴箱內(nèi)進(jìn)行老化處理16 d，然后將種子恢復(fù)至室溫后存放于4 ℃冰箱內(nèi)備用，每個(gè)處理4次重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1老化后抗氧化劑引發(fā)處理 將老化的無(wú)芒雀麥種子分別浸入AsA溶液(2 mmol·L-1)、GSH溶液(0.25 mmol·L-1)、MT溶液(100 μmol·L-1)以及蒸餾水(WT)中，在4 ℃冰箱中引發(fā)2 h，每個(gè)處理重復(fù)4次。引發(fā)后用蒸餾水沖洗3次，并用濾紙將種子表面的水分擦干，在室溫下晾至含水量10.0%時(shí)的重量后封入鋁箔袋中存放于4 ℃冰箱中備用。以老化后未引發(fā)的無(wú)芒雀麥種子(含水量為10.0%)作為對(duì)照(CK)。

1.2.2種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 參照國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)種子檢驗(yàn)規(guī)程(2016)[19]，選取均勻飽滿一致的無(wú)芒雀麥種子100粒，將其置于內(nèi)部墊有3層濾紙的11.5 cm×11.5 cm的培養(yǎng)皿中，設(shè)4次重復(fù)。培養(yǎng)皿放于光照培養(yǎng)箱(GXZ-380B-LED，寧波江南儀器廠)中在15/25 ℃變溫，光照8 h和黑暗16 h條件下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為66%。每24 h統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽情況，以胚根突破種皮2 mm為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算平均發(fā)芽時(shí)間；以正常種苗作為種子發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，第7天初次計(jì)數(shù)，第14天末次計(jì)數(shù)，計(jì)算發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率。待第14天發(fā)芽結(jié)束后，從中隨機(jī)取10株正常種苗測(cè)量幼苗長(zhǎng)和根長(zhǎng)，并對(duì)這10株種苗進(jìn)行稱重。計(jì)算發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、幼苗長(zhǎng)、根長(zhǎng)、苗重、平均發(fā)芽時(shí)間、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。具體計(jì)算方法如下：

發(fā)芽勢(shì)(%)=發(fā)芽初次計(jì)數(shù)的正常種苗數(shù)/供試種子數(shù)

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽終期全部正常種苗數(shù)/供試種子數(shù)

平均發(fā)芽時(shí)間=∑nt/∑n

式中：n為在時(shí)間t時(shí)，新萌發(fā)的種子數(shù)，t為發(fā)芽時(shí)間。

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)

式中：Gt為第t天的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)(d)。

活力指數(shù)=∑(Gt/Dt)×WF

式中：WF為苗重(g)。

1.2.3酶活性測(cè)定 選取0.1 g無(wú)芒雀麥種子，加入6 mL預(yù)冷的50 mmol·L-1pH 7.0的磷酸緩沖液(含0.1 mmol·L-1EDTA和1% pvp)和少量石英砂置于預(yù)冷的研缽中研磨至勻漿，然后將勻漿倒入離心管中混勻。所得勻漿在4 ℃ 8000 r·min-1下離心10 min，上清液為粗酶提取液。將粗酶液分裝進(jìn)行超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)和過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活性的測(cè)定。采用氮藍(lán)四唑(nitroblue tetrazolium，NBT)法測(cè)定SOD活性[20]；采用愈創(chuàng)木酚顯色法測(cè)定POD活性[21]；采用紫外吸收法測(cè)定CAT活性[22]。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量，試劑盒購(gòu)自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0對(duì)老化種子的發(fā)芽、幼苗生長(zhǎng)和酶活性指標(biāo)進(jìn)行方差分析，并在GraphPad Prism 7軟件中作圖。在PAST 3.15軟件[23]中對(duì)5組試驗(yàn)(AsA、GSH、MT、WT和CK)測(cè)定的4個(gè)種子發(fā)芽指標(biāo)(發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、平均發(fā)芽時(shí)間和發(fā)芽指數(shù))和4個(gè)幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)(葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)、幼苗重和活力指數(shù))進(jìn)行了歐式距離計(jì)算和基于非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)的聚類分析，采用bootstrap重復(fù)1000次。對(duì)4組引發(fā)處理(AsA、GSH、MT和WT)的8個(gè)發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，以特征值大于1提取主成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化劑引發(fā)對(duì)老化種子發(fā)芽的影響

圖1 抗氧化劑引發(fā)對(duì)無(wú)芒雀麥老化種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響Fig.1 Effects of different antioxidants priming on germination percentage and germination potential of aged seeds of smooth bromegrass 同一指標(biāo)中不同小寫字母代表處理間差異顯著(P<0.05)，下同。Means designated by different lowercase letters indicate different significantly between treatments at 0.05 level, the same below.

圖2 抗氧化劑引發(fā)對(duì)無(wú)芒雀麥老化種子平均發(fā)芽時(shí)間、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響Fig.2 Effects of different antioxidants priming on mean germination time, germination index and vigor index of smooth bromegrass aged seeds

無(wú)芒雀麥老化種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)分別為67%和23%，說(shuō)明老化處理后種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均有所降低，而且發(fā)芽勢(shì)降低程度遠(yuǎn)大于發(fā)芽率(圖1)。經(jīng)過(guò)水和抗氧化劑引發(fā)后，無(wú)芒雀麥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均高于CK，平均發(fā)芽時(shí)間短于CK(圖1和圖2)。與CK相比，發(fā)芽率在水引發(fā)處理(WT)下提升了8.00%，但未達(dá)到顯著水平(P>0.05)；在各抗氧化劑處理下則均有顯著提升(P<0.05)，平均提升15.17%，其中GSH提升效果最佳為17.00%，為水引發(fā)提升效果的兩倍多。經(jīng)過(guò)引發(fā)的種子與CK相比，發(fā)芽勢(shì)的提升效果比發(fā)芽率更好。經(jīng)過(guò)引發(fā)(WT、AsA、GSH和MT)后發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均顯著提升(P<0.05)，分別平均提升41.75%和14.36%(圖1和圖2)。雖然各引發(fā)處理之間沒有顯著差異(P>0.05)，但抗氧化劑引發(fā)的效果均比水引發(fā)好，其中GSH引發(fā)對(duì)發(fā)芽勢(shì)提升效果最好(44.50%)，而AsA對(duì)發(fā)芽指數(shù)的提升效果最好(16.10%)?？寡趸瘎┮l(fā)處理后種子活力指數(shù)也顯著(P<0.05)高于CK和水引發(fā)處理，且AsA引發(fā)處理的活力指數(shù)顯著(P<0.05)高于MT引發(fā)，但GSH引發(fā)處理與AsA和MT引發(fā)處理之間沒有顯著差異(P>0.05，圖2)。此外，經(jīng)過(guò)引發(fā)處理后，老化種子的平均發(fā)芽時(shí)間與CK相比均有顯著的縮短(P<0.05)，但引發(fā)處理之間沒有顯著差異(P>0.05)?？寡趸瘎┮l(fā)后老化種子第7天的發(fā)芽率高于水引發(fā)處理，而達(dá)到50%發(fā)芽率所需時(shí)間比水引發(fā)稍長(zhǎng)(圖1和圖2)，說(shuō)明抗氧化劑對(duì)老化種子的生理效應(yīng)需要一定的作用時(shí)間。

2.2 抗氧化劑引發(fā)對(duì)無(wú)芒雀麥幼苗生長(zhǎng)的影響

圖3 抗氧化劑引發(fā)對(duì)無(wú)芒雀麥老化種子幼苗生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of different antioxidants priming on seedling growth characteristics of smooth bromegrass aged seeds

無(wú)芒雀麥老化種子的幼苗生長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果表明(圖3)，經(jīng)WT、AsA、GSH和MT引發(fā)后，無(wú)芒雀麥種苗的葉片和根均顯著(P<0.05)長(zhǎng)于CK，幼苗重量也顯著(P<0.05)高于CK。與WT處理相比，葉長(zhǎng)在抗氧化劑引發(fā)下平均提高了7.70%，但僅GSH處理具有顯著差異(P<0.05)，其余各抗氧化劑處理之間差異不顯著(P>0.05)；根長(zhǎng)在抗氧化劑引發(fā)處理下同樣有所提升，平均提升15.36%，GSH引發(fā)處理的提升效果最佳為20.09%，顯著(P<0.05)高于WT和AsA處理；苗重經(jīng)抗氧化劑引發(fā)處理后均顯著高于WT處理，在3種抗氧化劑中提升效果最佳的為AsA處理，提升32.11%，其次為MT和GSH處理(圖3)。

2.3 抗氧化劑引發(fā)對(duì)無(wú)芒雀麥老化種子酶活性的影響

經(jīng)過(guò)抗氧化劑引發(fā)處理后，無(wú)芒雀麥老化種子抗氧化酶的活性變化呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律(圖4)。引發(fā)后老化種子的SOD活性降低，且只有GSH引發(fā)后SOD活性顯著(P<0.05)下降，其余各處理(WT、AsA和MT)之間及其與CK之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)，表明GSH引發(fā)顯著(P<0.05)降低老化種子的SOD活性。POD活性在抗氧化劑引發(fā)處理后與CK和WT處理相比均顯著(P<0.05)升高，但MT、AsA和GSH引發(fā)處理之間沒有顯著(P>0.05)差異。此外，用AsA和GSH引發(fā)后老化種子的CAT活性與CK和WT相比顯著(P<0.05)升高，而且AsA、GSH和MT引發(fā)處理間CAT活性差異顯著(P<0.05)，且MT引發(fā)處理CAT酶活性最低。

圖4 抗氧化劑引發(fā)對(duì)無(wú)芒雀麥老化種子酶活性的影響Fig.4 Effects of different antioxidants priming on antioxidase activity in smooth bromegrass aged seeds

2.4 聚類和主成分分析

各試驗(yàn)組之間的歐氏距離范圍介于4.74～51.79，平均值為23.70，其中GSH和MT之間的距離最小，GSH和CK之間的距離最大，說(shuō)明GSH對(duì)老化種子的生理影響最大，而與MT的作用相當(dāng)(表2)。聚類分析結(jié)果顯示(圖5)，在閾值為23.78處被分為兩組，CK(Cluster Ⅰ)和引發(fā)處理(Cluster Ⅱ & Ⅲ)，而且可以看出水引發(fā)(Cluster Ⅱ)和抗氧化劑引發(fā)(Cluster Ⅲ)也可以明顯的分開，并且具有較高的自展支持率(100%)。

表2 基于種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的歐氏距離分析Table 2 Euclidean distance of control and 4 treatments based on 8 indexes of seed germination and seedling growth

圖5 基于種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的聚類分析Fig.5 Dendiagram of the control and 4 treatments revealed by UPGMA cluster analysis of Euclidean distance based on 8 indexes

主成分分析發(fā)現(xiàn)(表3)，特征值大于1的只有主成分1為3.9968，其貢獻(xiàn)率高達(dá)99.92%，說(shuō)明主成分1能代表8個(gè)指標(biāo)幾乎所有的信息，對(duì)其影響最大的指標(biāo)是發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。由此可見，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率在諸多指標(biāo)中可以更好地反映不同抗氧化劑引發(fā)對(duì)老化種子作用的差異。

3 討論

種子內(nèi)的ROS積累與清除之間動(dòng)態(tài)的失衡是種子老化的主要因素，其中ROS的清除主要通過(guò)增強(qiáng)抗氧化物酶活性和增加非酶促抗氧化劑的含量來(lái)實(shí)現(xiàn)[7]。CAT、POD和SOD是植物抗氧化酶體系中非常重要的3種防御酶類，其中SOD被認(rèn)為是植物細(xì)胞清除ROS的第一道防線，主要催化O2-的歧化反應(yīng)生成H2O2和O2；CAT可以高效催化H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2，該途徑為種子中H2O2清除的重要途徑；POD則是以H2O2為電子受體催化底物氧化的酶。此外，AsA、GSH和MT等抗氧化劑均不同程度地參與了自由基攻擊的防御，其中AsA和GSH不僅可以單獨(dú)與ROS反應(yīng)，還可以間接通過(guò)AsA-GSH循環(huán)來(lái)清除自由基。因此，這些酶和抗氧化劑在種子活力研究中扮演著非常重要的角色，往往高活力的種子具有相對(duì)較高的SOD、CAT、POD活性，而與之相伴的是較高的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、活力指數(shù)和抗逆性等[24]。這樣的結(jié)果在非生物脅迫或外源處理正常種子中普遍存在，但利用抗氧化劑引發(fā)處理老化種子的研究報(bào)道幾乎很少。

表3 不同引發(fā)處理后種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)相關(guān)指標(biāo)的主成分分析Table 3 Principal component analysis of 8 indexes related to seed germination and seedling growth after priming treatments

本研究通過(guò)抗氧化劑AsA、GSH和MT引發(fā)試驗(yàn)來(lái)探討抗氧化劑、抗氧化物酶以及老化種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)之間的關(guān)系。供試的無(wú)芒雀麥種子在10%含水量45 ℃條件下老化16 d后種子的發(fā)芽率達(dá)到66%，說(shuō)明該種子批的活力已經(jīng)處于中等水平，而燕麥(Avenasativa)種子在同等條件下老化16 d后其活力仍然處于相對(duì)較高的水平，且以往研究發(fā)現(xiàn)籽粒小的種質(zhì)更耐老化[25]，這可能與種子收獲條件和物種自身抗氧化機(jī)制差異有關(guān)。王彥榮等[26]利用聚乙二醇對(duì)紫花苜蓿(Medicagosativa)和沙打旺(Astragalusadsurgens)種子進(jìn)行引發(fā)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)中等質(zhì)量的種子具有更好的引發(fā)作用。本試驗(yàn)利用水、AsA、GSH和MT對(duì)老化的無(wú)芒雀麥種子進(jìn)行引發(fā)，發(fā)現(xiàn)水對(duì)無(wú)芒雀麥老化種子的發(fā)芽有明顯的促進(jìn)作用，但種子發(fā)芽率顯示水引發(fā)修復(fù)后種子仍然處于中等活力，而經(jīng)過(guò)抗氧化劑引發(fā)處理的老化種子發(fā)芽率均達(dá)到高活力水平(發(fā)芽率≥80%)，說(shuō)明抗氧化劑對(duì)老化種子修復(fù)作用的水平更高。Brilhante等[27]研究人工加速老化的豇豆(Vignaunguiculata)種子發(fā)現(xiàn)，AsA直接處理能減輕電解質(zhì)滲透率和脂質(zhì)過(guò)氧化程度，并增加種子的發(fā)芽率，而老化前用AsA處理則不能。但Yan等[28]發(fā)現(xiàn)利用適宜濃度的AsA提前引發(fā)也可以減小種子在老化過(guò)程中發(fā)芽率的降低。Tommasi等[29]發(fā)現(xiàn)在老化的種子中GSH的含量發(fā)生下降，而Draganic等[30]外源添加GSH后老化種子的發(fā)芽率提升。MT在種子老化方面的研究幾乎很少，但其對(duì)鹽脅迫和高溫脅迫下種子的發(fā)芽率有明顯提升[14]。一般認(rèn)為，水分引發(fā)主要是通過(guò)種子緩慢吸水，使損傷的細(xì)胞膜有充分時(shí)間進(jìn)行修復(fù)和重組，降低種子內(nèi)有機(jī)物質(zhì)的外滲來(lái)提高種子活力[31]?？寡趸瘎┮l(fā)效果更佳可能是抗氧化劑如AsA、GSH和MT等在細(xì)胞膜被修復(fù)前浸入被損傷的細(xì)胞內(nèi)部，參與了種子內(nèi)部的代謝活動(dòng)，與種子自身的修復(fù)系統(tǒng)共同對(duì)ROS造成的損傷進(jìn)行修復(fù)，并促進(jìn)了種子的萌發(fā)[7]。以往的研究還發(fā)現(xiàn)AsA能夠調(diào)節(jié)種子萌發(fā)過(guò)程中脫落酸(abscisic acid，ABA)和赤霉素(gibberellin，GA)的拮抗作用，進(jìn)而提高發(fā)芽率[32]。本研究中分析的CAT和POD的活性在抗氧化劑的作用下基本都有顯著的提升，這與老化處理或脅迫處理下抗氧化劑對(duì)老芒麥(Elymussibiricus)[28]、黃瓜(Cucumissativus)[14]和榆樹(Ulmuspumila)[33]等的影響基本一致。SOD的活性在引發(fā)后并沒有得到提升，反而有所降低，與老芒麥[28]和黃瓜[14]的研究結(jié)果不同，這可能與無(wú)芒雀麥種子老化的過(guò)程中積累的ROS種類有關(guān)，比如SOD主要參與清除的ROS(如O2-)沒有過(guò)度積累，而是一些其他的ROS(如H2O2等)積累造成了無(wú)芒雀麥種子的老化損傷，使得抗氧化劑引發(fā)沒能引起SOD活性的升高，但這種推測(cè)還需要在以后試驗(yàn)中通過(guò)測(cè)定ROS的產(chǎn)生來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。綜合以往的研究和本研究的結(jié)果，抗氧化劑對(duì)種子修復(fù)和促進(jìn)發(fā)芽的活動(dòng)可能主要包括細(xì)胞膜系統(tǒng)的修復(fù)，胚根的突出，抗氧化相關(guān)酶活性的改變以及內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)[18]，而且抗氧化劑對(duì)種子的修復(fù)過(guò)程遠(yuǎn)比水分對(duì)種子的修復(fù)復(fù)雜，需要更長(zhǎng)時(shí)間才能達(dá)到比水引發(fā)更好地效果。此外，抗氧化劑處理的無(wú)芒雀麥老化種子發(fā)芽后，還表現(xiàn)出比水引發(fā)更長(zhǎng)的幼苗、根長(zhǎng)以及更高的幼苗重，說(shuō)明抗氧化劑在促進(jìn)發(fā)芽后，還活化了水解酶，動(dòng)員了種子貯藏組織中貯藏物質(zhì)的水解，為幼苗生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)。

種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)相關(guān)指標(biāo)是衡量不同狀態(tài)下種子活力情況的直觀表現(xiàn)。通過(guò)對(duì)不同試驗(yàn)組進(jìn)行聚類，發(fā)現(xiàn)可以將抗氧化劑引發(fā)和未使用抗氧化劑的試驗(yàn)區(qū)分開來(lái)，說(shuō)明在發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)情況方面抗氧化劑整體作用明顯。其中GSH引發(fā)與未引發(fā)的種子之間歐氏距離最大，與MT引發(fā)的種子之間的距離最近，說(shuō)明GSH引發(fā)對(duì)無(wú)芒雀麥老化種子的作用在4種引發(fā)處理中最有效果，而與MT引發(fā)處理在發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)情況方面差異不大。此外，主成分分析結(jié)果顯示，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)在諸多指標(biāo)中可以更好地反映引發(fā)劑引發(fā)對(duì)老化種子在發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)上的響應(yīng)。

4 結(jié)論

綜上所述，適宜濃度的AsA、GSH和MT溶液引發(fā)對(duì)無(wú)芒雀麥老化種子的發(fā)芽和幼苗的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，表現(xiàn)為提升了老化種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，縮短了平均發(fā)芽時(shí)間，并增加了幼苗的重量以及根長(zhǎng)和葉長(zhǎng)，其中GSH溶液引發(fā)的整體效果最佳。3種抗氧化劑在引發(fā)處理中的作用不盡相同，它們都顯著提高了老化種子的活力指數(shù)、苗重和POD活性(P<0.05)，其中AsA和GSH還顯著提高了CAT活性(P<0.05)，而且GSH還顯著提高了根長(zhǎng)(P<0.05)。此外，3種抗氧化劑對(duì)老化種子中SOD的活性均沒有顯著影響(P>0.05)。說(shuō)明不同的抗氧化劑在修復(fù)老化種子時(shí)，對(duì)抗氧化酶的作用具有選擇性，可能與不同物種或老化條件下產(chǎn)生的ROS種類有關(guān)。而且抗氧化劑引發(fā)對(duì)老化種子修復(fù)的可能更為復(fù)雜，需要較長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)達(dá)到更好的作用效果。