鄧坦 甘婕

摘要：以金釵石斛一年生莖段組織為外植體，采用不同種類的培養(yǎng)基與不同配比的添加物進(jìn)行了培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：以MS培養(yǎng)基-+-6-BA0.5mg/L+NAA 0.3rag/L+1g/L活性炭，加入10%的馬鈴薯作為天然添加物，pH值為5.8時(shí)，是金釵石斛叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基。

關(guān)鍵詞：金釵石斛;莖段;叢生芽誘導(dǎo)

中圖分類號(hào)：$641.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-9944（2019）15-0102-04

1引言

金釵石斛（Dendrobium nobile LindI），屬于蘭科植物，多年生草本，其莖含有生物堿，主要為石斛堿（den-drobine）、6-羥基石斛堿（6-hydroxydendrobine）、石斛次堿（nobilonine）、多糖和多種游離氨基酸等。金釵石斛總生物堿的含量多達(dá)0.755%，多糖含量高達(dá)22.5%，屬于上品藥用石斛。研究顯示：金釵石斛含藥用成分有15種之多，性不熱、不溫、不涼，養(yǎng)胃、清熱解毒、止咳清肺、軟化血管等多重功效，需求量大，前景好。金釵石斛的花奇特并且鮮艷，因此具有觀賞價(jià)值。金釵石斛能進(jìn)行光合作用的有效面積小，光合效率較低，生長(zhǎng)發(fā)育速率低，對(duì)氣候條件要求非?？量?，在自然的條件下金釵石斛需要與某些真菌互利共生才能生長(zhǎng)，因此對(duì)于苗的栽培往往很難實(shí)現(xiàn)，而過去采用的分株、扦插等方式的繁殖率較低，金釵石斛的供需不平衡，當(dāng)下我國(guó)將其列為中藥植物重點(diǎn)保護(hù)對(duì)象。目前國(guó)內(nèi)主要采用快繁的方式來(lái)克服并解決各類石斛的供需問題，因此，金釵石斛的組織培養(yǎng)至關(guān)重要，這是實(shí)現(xiàn)金釵石斛大規(guī)模繁殖的途徑之一。本研究有助于探索如何快速培養(yǎng)金釵石斛，因此采用金釵石斛的莖段組織進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，確保金釵石斛的供應(yīng)。

2材料與方法

2.1實(shí)驗(yàn)材料

本次實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源于赤水金釵石斛栽培基地，通過移栽培育苗到實(shí)驗(yàn)室種植，以供實(shí)驗(yàn)使用。

2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1第一組設(shè)計(jì)

不同植物提取液的培養(yǎng)基對(duì)金釵石斛莖段組織芽誘導(dǎo)的影響。

選取金釵石斛莖幼嫩的莖段部分，將外植體放人不同植物提取液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)狀況，從中選出莖段組織芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基。

2.2.2第二組設(shè)計(jì)

不同植物提取液的培養(yǎng)基在加入活性炭后對(duì)金釵石斛莖段組織芽誘導(dǎo)的影響。

選取金釵石斛莖的幼嫩的莖段部分，將外植體放入不同的植物提取液在加入活性炭的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)狀況，并對(duì)比在只加入植物提取液和加入植物提取液和活性炭的萌芽率情況，從而選出最適合金釵石斛莖段組織芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

2.2.3第三組設(shè)計(jì)

相同的植物提取液對(duì)比活性炭的有無(wú)對(duì)金釵石斛莖段組織芽誘導(dǎo)的影響。

選取金釵石斛莖的幼嫩的莖段部分，將外植體放入相同的植物提取液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，但是其中一組加入活性炭，對(duì)比在只加入植物提取液和加入植物提取液和活性炭的生長(zhǎng)情況，從而選出最適合金釵石斛莖段組織芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

2.2.4分組實(shí)驗(yàn)

將此次實(shí)驗(yàn)分為三大組（表1）。

3實(shí)驗(yàn)過程

3.1接種前接種室的準(zhǔn)備

首先接種室要時(shí)刻保持干凈，接種前要對(duì)接種室進(jìn)行清潔，清掃干凈每個(gè)角落，并用酒精擦拭地板，將酒精燈、濾紙、酒精棉球、75%酒精、無(wú)菌水、鑷子、手術(shù)刀等實(shí)驗(yàn)試劑及實(shí)驗(yàn)工具器械放入超凈工作臺(tái)。打開超凈工作臺(tái)里的紫外燈和接種室內(nèi)的紫外燈進(jìn)行消毒滅菌，照射2h。照射時(shí)間到后將紫外燈關(guān)閉，并打開超凈工作臺(tái)，風(fēng)機(jī)適度風(fēng)力吹5～6min后，即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.2外植體處理和接種

選出沒有病害且長(zhǎng)勢(shì)好的當(dāng)年生長(zhǎng)的幼莖，將節(jié)上的葉片去掉，再置于燒杯中，用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗10min，沖洗后再放入洗潔精溶液中清洗2min，再用自來(lái)水沖洗一次，再用無(wú)菌水將其漂洗3次（使外植體的大量菌流走），最后置于干凈的燒杯接種備用。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作前，將雙手用酒精仔細(xì)消毒，以防止一開始就將細(xì)菌帶入超凈工作臺(tái)。在超凈工作臺(tái)上，首先將工作臺(tái)擦拭干凈，將酒精燈點(diǎn)燃，將濾紙擺放好，將準(zhǔn)備好的金釵石斛的莖段組織放在濾紙上，用實(shí)驗(yàn)工具將其切成大小適中的小節(jié)，長(zhǎng)約為5cm，方便進(jìn)行消毒滅菌，將切好的莖段組織放進(jìn)錐形瓶中，倒入75%的酒精搖蕩處理30s，處理時(shí)間到后立即倒出酒精并及時(shí)倒入無(wú)菌水，然后反復(fù)清理潤(rùn)洗2～3次，再加入準(zhǔn)備好的0.1%升汞處理材料8min。實(shí)驗(yàn)操作過程中，要來(lái)回、反復(fù)的搖動(dòng)錐形瓶，保證材料能夠充分滅菌，處理時(shí)間到后將升汞倒人回收瓶，并用無(wú)菌水清洗2～3次。最后將材料取出放在濾紙上并切成帶節(jié)的小段，每段約長(zhǎng)為1.5cm，之后接入培養(yǎng)基中，一瓶培養(yǎng)基接種一小段或兩段。為避免相互污染，接種完后對(duì)其進(jìn)行編號(hào)，然后放入培養(yǎng)室對(duì)其進(jìn)行觀察、記錄生長(zhǎng)數(shù)據(jù)。接種過程中所用實(shí)驗(yàn)工具都要進(jìn)行高溫滅菌，盡量避免交叉接觸，在實(shí)驗(yàn)中，操作要輕、慢，以減少污染率。

3.3培養(yǎng)條件

適宜的培養(yǎng)條件對(duì)金釵石斛的組織培養(yǎng)非常重要，因此我們選擇將接種好的外植體置于光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25～28℃，每天用日光燈照射12h，光照強(qiáng)度為2000Lx，并定期觀察莖段組織的生長(zhǎng)情況。

4結(jié)果與分析

4.1不同植物提取液對(duì)金釵石斛莖段組織芽誘導(dǎo)的結(jié)果

5討論

本次實(shí)驗(yàn)采用不同添加物的培養(yǎng)基對(duì)金釵石斛莖段組織進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，以不同的培養(yǎng)基對(duì)金釵石斛叢生芽的情況來(lái)選出最適合繁殖金釵石斛的方法。通過3種不同添加物對(duì)金釵石斛莖段組織的叢生芽誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過60d的培養(yǎng)，可以明顯觀察到區(qū)別。通過表2我們可以得知，馬鈴薯有利于誘導(dǎo)芽的增殖，其中以MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L-t-10%馬鈴薯培養(yǎng)基最佳;在第一組實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，加入了活性炭進(jìn)行對(duì)比，由此，通過表3可以得知MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+10%馬鈴薯在加人1g/L活性炭時(shí)為最佳;最后，單獨(dú)將5種不同的培養(yǎng)基進(jìn)一步的進(jìn)行對(duì)比，可以發(fā)現(xiàn)MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+10%馬鈴薯+1g/-活性炭培養(yǎng)基的誘導(dǎo)芽數(shù)最高。

適宜的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基對(duì)金釵石斛的莖段組織叢生芽的培養(yǎng)和快速繁殖十分重要，通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)我們可以清楚地發(fā)現(xiàn)在添加活性炭后莖段組織從生芽的數(shù)量顯著增加，這是由于活性炭吸附了莖段組織叢生芽增殖中代謝過程中的廢棄物，促進(jìn)金釵石斛的形態(tài)發(fā)生和器官形成。馬鈴薯能促進(jìn)莖段組織叢生芽的分化，在添加馬鈴薯的培養(yǎng)基中再加入活性炭，此時(shí)對(duì)于金釵石斛莖段組織叢生芽的生長(zhǎng)效果更為顯著。金釵石斛的莖段組織在添加香蕉汁后對(duì)于叢生芽的增殖有明顯的壓制影響作用，造成這種現(xiàn)象很可能是因?yàn)橄憬吨泻袑?duì)莖段組織叢生芽誘導(dǎo)生長(zhǎng)的抑制性物質(zhì)，但香蕉汁能使根系生長(zhǎng)的粗壯，對(duì)于莖段組織的叢生芽增值、分化沒有明顯的作用。

在叢生芽誘導(dǎo)的過程中，消毒、滅菌是一項(xiàng)十分重要的工作，關(guān)系到整個(gè)實(shí)驗(yàn)的成敗。本次實(shí)驗(yàn)的污染率比較高，其中一些污染菌類是分散在培養(yǎng)基中，也有一些是從材料周圍長(zhǎng)起。污染的原因很可能是由于接種使用的實(shí)驗(yàn)工具器械的滅菌不徹底、接種時(shí)瓶的開口時(shí)間太長(zhǎng)、接種室內(nèi)物品擺放雜亂、接種室紫外燈的滅菌時(shí)間太短、接種材料沒有進(jìn)行徹底的滅菌、材料自帶的共生菌等原因。