李文娟，王李陽

（陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119）

1 前言

將器官或組織工程學(xué)應(yīng)用于人體以解決器官組織的再生問題，是現(xiàn)今生物工程領(lǐng)域一個(gè)重要的研究方向。首先在體外構(gòu)建器官或組織，而后將其移植到體內(nèi)替代因疾病衰竭或意外損壞而導(dǎo)致壞死的器官，整個(gè)過程大多具有非侵入性，即在不對(duì)生物體實(shí)施侵犯性策略時(shí)，就可實(shí)施替代。這種技術(shù)很大程度上克服了供體不足的局限性，極有可能在根本上解決器官移植的重大問題。自干細(xì)胞應(yīng)用于生物工程領(lǐng)域以來，組織工程已取得了很大的突破，比如再生皮膚、人造骨骼、氣管等的出現(xiàn)。

器官移植供體的傳統(tǒng)來源為自體移植或者近親在血型匹配下供給，供體數(shù)量嚴(yán)重不足。20世紀(jì)90年代初，英國劍橋大學(xué)首次嘗試豬-人異種器官移植。豬器官與人器官在尺寸大小、生理特性和代謝功能上均相似，但豬器官作為移植器官仍有免疫排斥性，人體將其作為異物加以識(shí)別、確認(rèn)和排斥。2016年，哈佛大學(xué)計(jì)劃使用CRISPER-CAS9技術(shù)將豬和人免疫不匹配的45個(gè)相關(guān)基因進(jìn)行改造，以得到不被人類免疫系統(tǒng)排斥的體外器官。然而，該過程復(fù)雜且不可預(yù)見性強(qiáng)，到目前為止尚未徹底解決異種移植免疫相斥性的問題。

受體對(duì)移植物的免疫排斥性問題不僅是器官和組織移植醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要問題，同時(shí)也是器官或組織工程學(xué)的重要問題。2018年，動(dòng)物植物跨界交叉應(yīng)用于組織工程學(xué)研究。該研究進(jìn)展基于植物對(duì)動(dòng)物和人體的低免疫源性，其運(yùn)用使生物工程獲得了突破，這種極強(qiáng)的組織兼容性使器官或組織生物工程進(jìn)入一個(gè)實(shí)用性時(shí)期。本文對(duì)近年來動(dòng)植物跨界交叉應(yīng)用于組織工程學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展、工程模式和應(yīng)用優(yōu)勢(shì)進(jìn)行了較為詳盡的歸納，對(duì)該跨界交叉應(yīng)用過程亟待解決的問題進(jìn)行了總結(jié)，并對(duì)未來生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的可能性進(jìn)行了闡述。

2 器官組織工程的特點(diǎn)

器官組織工程學(xué)是一門緊密結(jié)合諸如干細(xì)胞再生生物學(xué)、納米技術(shù)的極具生命力的新興學(xué)科，學(xué)科初建顯示了強(qiáng)有力的發(fā)展趨勢(shì)。學(xué)科目標(biāo)明確，基本原理簡(jiǎn)明，具體原理為：①建立器官或組織（organ/tissue，O/T）構(gòu)架（Scaffold）；②在此構(gòu)架上種植細(xì)胞，最終形成再生器官或組織。種植的細(xì)胞的種類有體細(xì)胞和干細(xì)胞兩類，由于體細(xì)胞來源于已經(jīng)成熟的組織，其逐漸被多功能干細(xì)胞所替代。干細(xì)胞在這個(gè)O/T構(gòu)架提供的3D環(huán)境和其生長(zhǎng)和分化信號(hào)誘導(dǎo)下，粘附、增殖、遷移和分化，形成再生的器官或組織。O/T構(gòu)架用于提供未來組織的機(jī)械支持和傳遞細(xì)胞信息能量，控制再生組織的形狀和大小以及呈現(xiàn)具有時(shí)空準(zhǔn)確性的物理和化學(xué)分子信號(hào)，最終促進(jìn)干細(xì)胞增殖和分化。

器官組織工程O/T構(gòu)架主要為多糖/糖蛋白的材料或脫細(xì)胞的天然生物材料，其中細(xì)胞外基質(zhì)為其主要成分。O/T構(gòu)架主要分為兩類：①基于多糖/糖蛋白的天然材料與合成聚合材料的混合材料。通常，天然材料機(jī)械性較差，合成聚合物生物材料有著優(yōu)良的可加工性和結(jié)構(gòu)力學(xué)特征，但有潛在毒性，易引起炎癥反應(yīng)，混合材料有效地將兩者的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來。②脫細(xì)胞的天然生物材料。這種O/T構(gòu)架由于一定程度上保持了細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)架的完整性，因而不需要額外處理或修飾便可提供干細(xì)胞生長(zhǎng)分化需要的營養(yǎng)成分和時(shí)空調(diào)控因子，這從結(jié)構(gòu)上有效地解決了構(gòu)架供血不足的問題，因而脫細(xì)胞O/T構(gòu)架也是一種預(yù)血管化生物活性構(gòu)架（Scaffold）。

3 器官組織工程的重要突破和亟待解決的問題

器官組織構(gòu)建主要有兩種方式，即在體（in vivo）器官組織的和體外（in vitro）器官組織的再生體系，然而這兩種體系都面臨組織兼容性的問題，組織兼容性是目前器官組織構(gòu)建不可回避的科學(xué)問題。

3.1 在體器官組織的再生體系

目前，我國在在體器官組織的再生領(lǐng)域已取得引人注目的成就。2016年，曹誼林課題組成功在哺乳動(dòng)物體內(nèi)植入抗骨癌構(gòu)架。將阿霉素（ADM）混到多孔納米羥基磷灰石/膠原蛋白構(gòu)架中（ADM-PLGA-NHAC）后，對(duì)其在大鼠中進(jìn)行免疫應(yīng)答測(cè)試，在兔中評(píng)估骨修復(fù)能力和在裸鼠內(nèi)檢測(cè)抗腫瘤功效。實(shí)驗(yàn)證明，該構(gòu)架有著優(yōu)秀的生物兼容性，ADM的存在并未影響NHAC突出的骨修復(fù)能力。

ADM-PLGA-NHAC在腫瘤中的植入相較于直接往腹膜內(nèi)注射ADM，改善了抗腫瘤效果并減少了不良副作用。構(gòu)架具有優(yōu)異的緩釋藥性、骨修復(fù)和抗腫瘤功效，這使其成為有前景的抑制骨瘤的骨傳導(dǎo)性材料。在國際同行中，2018年，MIT的Langer課題組首次在靈長(zhǎng)類綠猴中測(cè)試了一種多孔可降解生物兼容性構(gòu)架對(duì)脊髓損傷的修復(fù)作用，其植入明顯改善了脊髓受損綠猴的運(yùn)動(dòng)能力。實(shí)驗(yàn)證實(shí)此構(gòu)架在靈長(zhǎng)類脊椎損傷治療中具有安全性和功效性，為進(jìn)一步用于臨床治療急性脊髓損傷提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3.2 體外組織的再生體系

2012年，干細(xì)胞研究成果獲得了諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，隨后多功能干細(xì)胞的引入使得器官組織工程進(jìn)入到發(fā)展的重要階段。干細(xì)胞可在構(gòu)架提供的合適的體外環(huán)境下，誘導(dǎo)分化形成各類細(xì)胞，最終構(gòu)建出器官。體外組織的再生體系具有重現(xiàn)器官發(fā)育的潛力，而且可以互作于細(xì)胞微環(huán)境，因而在疾病體外模擬、藥物測(cè)試和組織工程等領(lǐng)域有極大的發(fā)展前景。在最佳的構(gòu)架環(huán)境下，人多能干細(xì)胞可衍生出幾乎所有器官的類器官，如腸道、腎臟等，甚至包括大腦和視網(wǎng)膜，而且整個(gè)過程與體內(nèi)器官的發(fā)生過程相似。體外器官發(fā)生方法對(duì)每個(gè)器官都是特定的，通常是使用特定的生長(zhǎng)因子或者不同的營養(yǎng)組合來驅(qū)動(dòng)獲得器官前體，而后體外培養(yǎng)的干細(xì)胞會(huì)經(jīng)過細(xì)胞分選和干細(xì)胞的譜系提交和調(diào)控產(chǎn)生出器官內(nèi)的各類細(xì)胞。2016年，日本RIKEN中心在體外將人類胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)形成hESC視網(wǎng)膜組織，經(jīng)檢測(cè)該移植物可以在體內(nèi)存活并成熟，且移植物與宿主細(xì)胞之間有突觸連接形成，說明這種體外誘導(dǎo)的hESC視網(wǎng)膜具有一定的臨床效用。植物細(xì)胞也可在構(gòu)架上生長(zhǎng)，模擬出天然的生長(zhǎng)狀態(tài)。2015年，劍橋大學(xué)研究小組將擬南芥和百葉草等細(xì)胞，種植于人體組織工程中使用的生物兼容性Shear-spun納米微纖維構(gòu)架上，開發(fā)出一種植物細(xì)胞3D培養(yǎng)方法，可以模擬植物組織環(huán)境。這種在微觀尺度下探索植物細(xì)胞與環(huán)境相互作用的新技術(shù)，將為以后研究提供一種新的植物細(xì)胞培育方案。

3.3 解決器官移植受體對(duì)植入組織排斥性的現(xiàn)行對(duì)應(yīng)方案

無論是在體器官組織的再生體系還是體外組織的再生體系，器官組織工程現(xiàn)行的研究階段還是未來的臨床應(yīng)用，面臨最重大的問題都是受體對(duì)移植物的組織排斥性。哈佛大學(xué)的Church團(tuán)隊(duì)使用CRISPR-cas9編輯技術(shù)破壞了豬源上皮細(xì)胞系中所有的PERV，該技術(shù)為異種器官移植中免疫排斥性和PERV的感染問題提供了解決途徑，從而克服人類器官移植供體不足的問題，但使用CRISPR-cas9技術(shù)將豬的基因改造成類似于人類的基因，不僅技術(shù)上相當(dāng)煩瑣，且仍不能完全解決異源移植中組織排斥性的問題。

4 植物構(gòu)架應(yīng)用于動(dòng)物器官組織再建的特色

4.1 植物構(gòu)架與動(dòng)物性構(gòu)架的特性比較

植物構(gòu)架應(yīng)用于動(dòng)物器官組織工程在保持了傳統(tǒng)構(gòu)架特點(diǎn)的同時(shí)，凸現(xiàn)出許多動(dòng)物性構(gòu)架不具備的優(yōu)點(diǎn)。從共同特性上來看，主要有：①植物構(gòu)架保持了一些動(dòng)物蛋白材料和多糖材料以及脫細(xì)胞材料的特點(diǎn)，植物蛋白或多糖材料不僅保持了與動(dòng)物材料相類似的物理化學(xué)特性，易于構(gòu)建成各種形狀和大小的構(gòu)架，并可提供3D環(huán)境供干細(xì)胞生長(zhǎng)和分化；②植物脫細(xì)胞構(gòu)架中的葉脈系統(tǒng)與動(dòng)物組織中的脈管系統(tǒng)類似可進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，與動(dòng)物脫細(xì)胞構(gòu)架類似；③植物的基因修飾的可操作性，使得植物構(gòu)架與最新的科研成果如納米3D熱點(diǎn)技術(shù)、干細(xì)胞、CRISPR基因編輯、藥物篩選等有效地結(jié)合起來。

從獨(dú)特性質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)來看，植物構(gòu)架確實(shí)具有動(dòng)物構(gòu)架不具有的特點(diǎn)：①植物構(gòu)架對(duì)器官組織的移植受體沒有或有明顯較低免疫排斥性，與構(gòu)建細(xì)胞組織兼容性強(qiáng)，從而有可能徹底解決器官移植的免疫排斥性；②植物構(gòu)架低成本，供體數(shù)量無局限，無時(shí)間限制；③植物構(gòu)架有更高的極性，其親水性更優(yōu)，更利于種子細(xì)胞的粘附生長(zhǎng)；④植物構(gòu)架操作簡(jiǎn)單，易于投入大規(guī)模的研究，特別在基礎(chǔ)研究階段，有利于獲取具有臨床適用性的研究成果；⑤現(xiàn)代基因修飾技術(shù)暫無社會(huì)倫理的阻礙。使用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)人類蛋白用于構(gòu)建更加利于細(xì)胞生長(zhǎng)的構(gòu)架，植物源人重組膠原蛋白在組織工程中應(yīng)用，可在保持構(gòu)架優(yōu)異性能的前提下降低過敏和疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

4.2 植物構(gòu)架和動(dòng)物性構(gòu)架的制備方法

將來源不同的器官充分有效地脫細(xì)胞化，再種植細(xì)胞或干細(xì)胞，進(jìn)而用作器官移植物，是生物醫(yī)學(xué)界的一個(gè)挑戰(zhàn)，鑒于干細(xì)胞的全能性，社會(huì)對(duì)這一領(lǐng)域充滿希望。脫細(xì)胞構(gòu)架的制備原理主要是通過物理方法或化學(xué)方法將組織或器官中的細(xì)胞去掉，以降低構(gòu)架的免疫源性并保留細(xì)胞外基質(zhì)成分，最后使用干細(xì)胞將構(gòu)架再細(xì)胞化。由于脫細(xì)胞的不同方法會(huì)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)、構(gòu)架力學(xué)均有影響，因而評(píng)估脫細(xì)胞方法的標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)胞的去除率以及細(xì)胞外基質(zhì)的保留率。

4.2.1 動(dòng)物組織去細(xì)胞化——?jiǎng)游镄詷?gòu)架的獲得

由于動(dòng)物性構(gòu)架的使用一直是器官組織工程的經(jīng)典范例，動(dòng)物組織構(gòu)架脫細(xì)胞化較植物組織更為成熟。2016年，哈佛醫(yī)學(xué)院Ott團(tuán)隊(duì)采用SDS和內(nèi)切核酸酶灌注-脫細(xì)胞化的方法將人類心臟脫細(xì)胞化，得到微血管保存完整的無細(xì)胞人類心臟。脫細(xì)胞后的心臟蛋白量減少了89%，細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白顯著保留，不溶性脂肪組織基質(zhì)和脂質(zhì)分子仍保留在心外膜表面。將其在大鼠中進(jìn)行免疫生物兼容性測(cè)試發(fā)現(xiàn)，不同于原心臟和豬脫細(xì)胞心臟引起的M1巨噬細(xì)胞促炎反應(yīng)，人脫細(xì)胞構(gòu)架心臟引起的是M2巨噬細(xì)胞反應(yīng)。再細(xì)胞化后，人工心臟展現(xiàn)了能產(chǎn)生力的有代謝功能的心肌組織。2017年Vranckx等使用洗滌劑-酶促脫細(xì)胞化兔氣管。

4.2.2 植物組織去細(xì)胞化——植物構(gòu)架的獲得

植物組織去細(xì)胞化通常以兩種方法獲取植物構(gòu)架，即使用類似清洗哺乳動(dòng)物組織的去污劑方法和使用漂白劑簡(jiǎn)單的非去污劑方法。2018年Adamski團(tuán)隊(duì)證明，這兩種方法均產(chǎn)生了機(jī)械性質(zhì)好、對(duì)細(xì)胞代謝影響小的植物葉脈網(wǎng)絡(luò)構(gòu)架，并保留了植物葉脈天然的運(yùn)輸系統(tǒng)，營養(yǎng)運(yùn)輸能力和保水能力好，具有高表面積體積比。

植物構(gòu)架具有優(yōu)良的免疫相容性，已被再生生物工程研究者基本認(rèn)可。2016年，Pelling團(tuán)隊(duì)將制備的紅蘋果果肉脫細(xì)胞纖維素構(gòu)架植入免疫活性小鼠中，在鼠體中1周內(nèi)該構(gòu)架產(chǎn)生免疫應(yīng)答，4周后構(gòu)架周圍的表皮組織免疫應(yīng)答降低，8周后這些免疫應(yīng)答完全消失，纖維素構(gòu)架被宿主接受，所有小鼠均沒有明顯免疫性反應(yīng)的癥狀。

5 結(jié)論與展望

近年來，器官組織工程的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)及與多種前沿科學(xué)如納米技術(shù)、干細(xì)胞等領(lǐng)域的結(jié)合使其成為生物工程領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。無論是在體器官或組織再生還是體外器官或組織培養(yǎng)，構(gòu)架的特性都是組織工程中的關(guān)鍵問題。具有優(yōu)異的力學(xué)特征的各類構(gòu)架能否應(yīng)用于臨床決定于它的生物兼容性。合成聚合材料生物活性差、有低毒性，而動(dòng)物組織材料易于引起人體的免疫反應(yīng)，因而，植物組織的低免疫源性及其制備的簡(jiǎn)易性和易獲得性使其成為組織工程中解決這一關(guān)鍵問題的重要選擇。植物構(gòu)架應(yīng)用于動(dòng)物器官組織工程在保持了傳統(tǒng)構(gòu)架特點(diǎn)的同時(shí)，凸顯出許多動(dòng)物性構(gòu)架所不具備的優(yōu)點(diǎn)。