楊雅娟 李靜 朱琳 石俊杰 喬冠恩

摘要：目的 ?篩選并鑒定在食管鱗癌（ESCC）及癌旁組織中miRNAs的差異表達(dá)，為進(jìn)一步闡明其在ESCC發(fā)病機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。方法 ?選取在邯鄲市第一醫(yī)院行食管癌切除術(shù)患者新鮮的鱗癌組織及癌旁正常組織，各3例，抽提總RNA，利用miRNAs芯片篩選其中差異表達(dá)的miRNAs，并對miR-106b-3p通過進(jìn)一步RT-qPCR 技術(shù)進(jìn)行驗證。結(jié)果 ?miRNAs芯片從配對組織中共篩檢出62個差異表達(dá)的miRNAs，其中41個miRNAs表達(dá)上調(diào)，21個miRNAs表達(dá)下調(diào)，鱗癌組織與癌旁正常組織中差異表達(dá)的miRNAs比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。miR-106b-3p在ESCC組織中的表達(dá)高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與芯片結(jié)果一致。結(jié)論 ?食管鱗癌組織中miRNAs的差異表達(dá)為進(jìn)一步研究miRNAs在ESCC發(fā)病中的作用奠定了基礎(chǔ);miR-106b-3p的高表達(dá)可能與ESCC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

關(guān)鍵詞：食管鱗癌;miRNAs芯片;microRNAs

中圖分類號：R735.1 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.20.018

文章編號：1006-1959（2019）20-0063-04

Screening and Study of Differential Expression Profiles of miRNAs in

Esophageal Squamous Cell Carcinoma

YANG Ya-juan1，LI Jing1，ZHU Lin2，SHI Jun-jie3，QIAO Guan-en1

Abstract：Objective ?To screen and identify differential expression of miRNAs in esophageal squamous cell carcinoma （ESCC） and adjacent tissues， and to lay the foundation for further elucidation of its role in the pathogenesis of ESCC.Methods ?Fresh squamous cell carcinoma and adjacent normal tissues were obtained from patients with esophageal cancer resection in the First Hospital of Handan City， 3 cases were extracted， total RNA was extracted， and miRNAs were used to screen differentially expressed miRNAs， and miR-106b-3p was used. Verification by further RT-qPCR technology.Results ?A total of 62 differentially expressed miRNAs were screened from the paired tissues by miRNAs. Among them， 41 miRNAs were up-regulated， 21 miRNAs were down-regulated， and miRNAs were differentially expressed in squamous cell carcinoma and adjacent normal tissues，the difference was statistically significant （P<0.05）. The expression of miR-106b-3p in ESCC tissues was higher than that in adjacent tissues，the difference was statistically significant （P<0.05）， which was consistent with the chip results.Conclusion ?The differential expression of miRNAs in esophageal squamous cell carcinoma lays a foundation for further study of the role of miRNAs in the pathogenesis of ESCC. The high expression of miR-106b-3p may be related to the occurrence and development of ESCC.

Key words：Esophageal squamous cell carcinoma;miRNAs chip;microRNAs

食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是我國常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病的機(jī)制尚不清楚。microRNAs（miRNAs）是一類長度在22 nt左右的非編碼小RNAs，參與了人體內(nèi)大部分生物學(xué)調(diào)節(jié)途徑[1，2]。miRNAs能夠通過其堿基序列區(qū)域與其相應(yīng)靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）中的互補(bǔ)堿基序列進(jìn)行完全或不完全的互補(bǔ)結(jié)合，在基因的轉(zhuǎn)錄后階段調(diào)控其相應(yīng)靶基因mRNA的表達(dá)水平[3-5]。miRNAs芯片又稱microRNAs微陣列，可同時檢測數(shù)千個miRNAs的表達(dá)量，適用于miRNAs表達(dá)譜分析。本研究采用安捷倫miRNAs芯片技術(shù)篩選ESCC組織與癌旁正常組織差異表達(dá)的miRNAs，并對部分miRNA采用反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR（RT-qPCR）進(jìn)行驗證，為進(jìn)一步研究miRNAs在ESCC發(fā)生、發(fā)展過程中的作用提供參考。

1材料與方法

1.1材料來源 ?選取在邯鄲市第一醫(yī)院行食管癌切除術(shù)患者新鮮的鱗癌組織及癌旁正常組織，各3例。所有樣本均經(jīng)病理組織學(xué)證實，癌組織和癌旁組織一并保存，所有患者術(shù)前均無放、化療史。

1.2主要試劑 ?miRNAs芯片購自美國安捷倫公司，總RNA提取試劑盒RNAprep Pure Tissue Kit購自北京TIANGEN公司，熒光定量PCR試劑盒購自Roche Applied Science公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Applied Biosystems公司，引物由南京金斯瑞生物公司合成。

1.3方法

1.3.1組織總RNA的提取 ?從液氮中取出樣本，稱取約0.5 g組織放入缽中研磨（先用液氮預(yù)冷），邊研磨邊加液氮，待組織成粉末狀后轉(zhuǎn)到1.5 ml離心管中，按照RNA提取試劑盒操作說明書提取總RNA。

1.3.2芯片雜交及數(shù)據(jù)分析 ?采用安捷倫miRNAs芯片（V21.0）及配套的檢測儀器及試劑盒檢測，該芯片覆蓋2549個人源miRNAs。步驟如下：取100 ng 總RNA 經(jīng)Cy3 熒光標(biāo)記后，在雜交儀中與miRNAs芯片于55℃、20 r/min雜交 20 h，隨后用GE洗脫液1和2各洗5 min，最后用芯片掃描儀掃描。掃描完成后通過Feature Extraction軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的提取，原始數(shù)據(jù)文件經(jīng)Genespring標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。篩選差異表達(dá)的miRNAs，并對其進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類，用熱圖的形式顯示差異miRNAs在不同樣本間的表達(dá)情況。

1.3.3反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) ?按照試劑盒操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，RNA量為200 ng，加反轉(zhuǎn)錄引物1 μl，加雙蒸水至體積為11 μl，65℃孵育5 min，冰上預(yù)冷 ? ? ? ?5 min，加入反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μl，RNA酶抑制劑1 μl，dNTPs 2.0 μl，5× Reaction緩沖液 4.0 μl，至總體積為19 μl，42°C孵育60 min，70°C反應(yīng)10 min后立即取出冰浴冷卻，合成cDNA。

1.3.4 RT-qPCR ?合成cDNA 后，以Fast Start Universal SYBR Green Master （Rox）PCR試劑盒擴(kuò)增目的基因，U6為內(nèi)參基因，miR-106b-3p、U6 引物序列見表1。反應(yīng)體系為： cDNA 產(chǎn)物 1.0 μl，qPCR Mix10 μl，上游引物、下游引物各0.4 μl，余用雙蒸水補(bǔ)齊至20 μl。擴(kuò)增條件： 94 ℃預(yù)變性5 min，94℃30 s、60℃30 s、72℃30 s，40 個循環(huán)，設(shè)立 3 個復(fù)孔。根據(jù)擴(kuò)增曲線得到Ct值，miRNAs含量采用相對表達(dá)量 2- △△Ct表示。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 ?采用GraphPad 5.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1組織樣本總RNA質(zhì)量控制 ?3對送檢組織樣本檢測發(fā)現(xiàn)，各樣本RNA在18、28 s處見明顯峰值，A260/A280在1.9～2.1，表明RNA質(zhì)量和純度符合miRNAs芯片的檢測要求。

2.2芯片中差異表達(dá)的miRNAs ?芯片從配對組織中共篩檢出62個差異表達(dá)的miRNAs，其中表達(dá)上調(diào)有：miR-106b-3p、miR-193a-5p、miR-342-5p、miR-21-3p、miR-18a-5p、miR-500a-3p、miR-186-5p、miR-148b-5p、miR-123-5p、miR-3651、miR-128、miR-29b-1-5p、miR-523-3p、miR-505-3p、miR-18b-5p、miR-361-3p、miR-664b-3、miR-26a-5p、miR-181a-3p、miR-4286、let-7d-5p、miR-29c-3p、miR-107、miR-320b、miR-320d、miR-425-5p、miR-320e、miR-92a-3p、let-7f-5p、miR-181a-5p、miR-25-3p、miR-17-5p、miR-26b-5p、miR-155-5p、miR-16-5p、miR-30b-5p、miR-15b-5p、let-7g-5p、let-7a-5p、miR-30d-5p、miR-93-5p;表達(dá)下調(diào)的有：miR-3910-5p、miR-5787、miR-6126、miR-6722-3p、miR-4631、miR-4270、miR-150-3p、miR-4327、miR-4459、miR-6090、miR-30d-5p、miR-4166、miR-1290、miR-3196、miR-6087、miR-4530、miR-4687-3p、miR-1216、miR-1275、miR-1234-5p、miR-4665-3p，對差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行聚類分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;鱗癌組織與癌旁正常組織差異表達(dá)的miRNAs比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

2.3 RT-qPCR技術(shù)驗證 ?對表達(dá)上調(diào)的miR-106b-3p進(jìn)行進(jìn)一步驗證，結(jié)果顯示miR-106b-3p在ESCC組織中的表達(dá)高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與芯片結(jié)果一致，見圖2。

3討論

miRNAs在腫瘤中的表達(dá)與在正常組織或細(xì)胞的表達(dá)存在差異，疾病的不同階段以及不同組織或細(xì)胞中，miRNAs的表達(dá)和作用均不同。一個miRNA能調(diào)控多個靶mRNAs的表達(dá)，多個miRNAs也能共同調(diào)控一個靶mRNA發(fā)揮作用[6]。有研究顯示，通過PCR、芯片及測序等方法可發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)的miRNAs[7-9]。安捷倫miRNAs芯片為目前較為先進(jìn)的miRNAs表達(dá)譜芯片，具有高特異性、高靈敏性及可重復(fù)性，能與高通量測序相媲美，安捷倫 HumanmiRNAs V21.0芯片能檢測2549個成熟的miRNAs。

本研究通過對ESCC組織和癌旁組織中的miRNAs檢測，篩選出62個差異表達(dá)的miRNAs，其中上調(diào)的有41個，下調(diào)的有21個。進(jìn)一步對表達(dá)異常的miR-106b-3p采用RT-qPCR技術(shù)進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示miR-106b-3p在ESCC組織的表達(dá)要高于癌旁組織，與芯片結(jié)果一致，說明miRNAs 芯片能夠較準(zhǔn)確的反映各miRNA 在腫瘤樣本中的表達(dá)情況。

利用miRNAs芯片技術(shù)篩選癌組織miRNAs表達(dá)譜是發(fā)現(xiàn)異常miRNAs的常見手段。周萍[10]的研究選取了10例ESCC新鮮凍存組織及對應(yīng)的正常食管粘膜組織，采用上海康成生物有限公司代理的Exiqon公司的miRNAs表達(dá)譜芯片檢測，結(jié)果顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組ESCC患者相比較，差異表達(dá)的miRNAs共16個，其中表達(dá)上調(diào)的miRNAs有9個，表達(dá)下調(diào)的miRNAs有7個，經(jīng)RT-PCR驗證，與正常黏膜組織相比，ESCC組織中miR-612表達(dá)上調(diào)，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。姚麗[11]的研究對ESCC組織及正常食管黏膜組織的miRNAs表達(dá)譜統(tǒng)計分析，結(jié)果則顯示miRNAs差異表達(dá)共43個，其中27個miRNAs表達(dá)下調(diào)，16個miRNAs表達(dá)上調(diào);Okumura T[12]等通過芯片技術(shù)檢測了多種miRNAs的差異表達(dá)，確定了miR-574-3p和miR-106b的高表達(dá)與腫瘤無復(fù)發(fā)及良好的總生存率有關(guān)，miR-106b被認(rèn)為具有腫瘤抑制作用。本研究顯示有41個表達(dá)上調(diào)的miRNAs，其中miR-106b-3p表達(dá)明顯上調(diào)，說明通過miRNAs芯片能較好的篩選出有意義的差異表達(dá)miRNA，與上述研究結(jié)果不完全一致，分析原因可能與取材方法、疾病分期、試劑產(chǎn)地、異常表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)及miRNAs的時序性等有關(guān)。

總之，食管鱗癌組織中miRNAs的差異表達(dá)為進(jìn)一步研究miRNAs在食管鱗癌發(fā)病中的作用奠定了基礎(chǔ)，miR-106b-3p的高表達(dá)可能與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

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收稿日期：2019-8-4;修回日期：2019-8-12

編輯/肖婷婷