HPLC法同時測定多效防護霜中鹽酸苯海拉明、甲氧基肉桂酸辛酯和水楊酸辛酯的含量

韓 凌，王新霞，呂 磊，張靜如，闞月一，魯 瑩，傅 翔

(1.上?？亟t(yī)院藥劑科，上海 200093；2.上海東方肝膽外科醫(yī)院藥材科，上海 200438；3.海軍軍醫(yī)大學藥學院，上海 200433)

隨著我國開發(fā)海洋戰(zhàn)略的加速實施，部隊海上訓練和駐島守礁的任務日益繁重，長遠航已成為我海軍維護國家海洋權益、彰顯維護世界和平責任的常規(guī)軍事任務，任務執(zhí)行過程中，有毒海洋生物蟄傷和紫外線灼傷是減少非戰(zhàn)斗減員，提高軍事作業(yè)能力亟待解決的問題[1-2]。本研究根據(jù)課題組的前期基礎(高原防曬產(chǎn)品列裝高原部隊使用多年)，設計包括抑制刺絲囊發(fā)射的預防成分、舒緩蜇傷后局部癥狀的治療成分以及抗紫外線成分組成的兼具防護有毒海洋生物蜇傷和紫外線灼傷的多效防護霜[3-5]。該制劑可填補我海軍衛(wèi)勤保障軍特藥品種的空白，極大促進我軍海上衛(wèi)勤保障實力。

多效防護霜采用環(huán)戊硅氧烷、氫化蓖麻油、甲氧基肉桂酸辛酯、水楊酸辛酯、氧化鋅、二氧化鈦、鹽酸苯海拉明等成分制備而成，采用特殊處方工藝，確保防蟄傷成分和防曬劑成分在高濕及海水浸泡條件下維持有效濃度2 h以上，抗紫外線灼傷能力可靠(SPF值達到30)，可防水浸泡與沖刷。處方中鹽酸苯海拉明是防止有毒海洋生物蜇傷的成分之一，而甲氧基肉桂酸辛酯和水楊酸辛酯作為防曬劑是對抗紫外線的成分。本研究選擇多效防護霜中的3種藥效成分，采用HPLC法進行同時測定[6-8]，以期為制劑的質量標準研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Scientific U3000系列高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾公司)，配有四元泵、自動進樣器、柱溫箱和紫外檢測器；分析軟件為Chromeleon工作站。AL-104電子天平(瑞士梅特勒公司)；DL-360A超聲發(fā)生器(上海之信儀器有限公司)； VORTEX-6渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器有限公司)；Barnstead D3750超級純水儀(美國賽默飛世爾公司)。

1.2 藥品與試劑

對照品鹽酸苯海拉明(批號：100066-200807)購自中國食品藥品檢定研究院、二苯酮(批號：H179Z67919)購自鼎瑞化工有限公司、甲氧基肉桂酸辛酯(批號：PHR1080)、水楊酸辛酯(批號：PHR1081)購自Sigma公司(純度>98.0%)，乙腈和甲純?yōu)樯V純(Sigma公司，USA)，其余試劑均為分析純，水為純水。3批多效防護霜批號分別為20180726、20181129、20181205，均為實驗室自制。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取鹽酸苯海拉明、二苯酮、甲氧基肉桂酸辛酯和水楊酸辛酯對照品20.08、20.10、100.04、100.03 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度分別為2008.00、2010.00、10004.00、10003.00 μg/ml的對照品儲備液，其中二苯酮僅用于專屬性實驗。將其余3種儲備液各取0.5、1.0、1.0 ml，定容至10 ml量瓶中，并按1、2、5、10、15、20的比例逐級稀釋，即得系列濃度的混合對照品溶液，濃度分別為：鹽酸苯海拉明：5.02、10.04、25.10、50.20、75.30、100.40 μg/ml；甲氧基肉桂酸辛酯：50.02、100.04、250.10、500.20、750.30、1000.40 μg/ml；水楊酸辛酯：50.02、100.03、250.08、500.15、750.23、1000.30 μg/ml，置于4℃冰箱保存。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取多效防護霜1.0 g，置50 ml量瓶中，加入甲醇約35 ml，超聲20 min至完全破乳溶解(功率240 W，頻率40 kHz)，甲醇定容至50 ml，搖勻；取初提液1 ml，加乙腈1 ml，渦旋30 s，13 000 r/min離心5 min，取上清即得樣品溶液。置4℃冰箱密封，避光保存。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Extend-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)-乙酸銨緩沖溶液(B，20 mM，pH = 7.5)，梯度洗脫，A相比例隨時間變化為：0～10 min、A→60%；10～12 min、A 60%→92%；12～20 min、A→92%，采集時間20 min，平衡時間10 min，流速：1 ml/min；紫外檢測波長：218 nm；柱溫：25℃；進樣量：15 μl；外標法定量。

2.4 方法學驗證

2.4.1系統(tǒng)適用性試驗

按出峰順序，鹽酸苯海拉明、二苯酮、甲氧基肉桂酸辛酯、水楊酸辛酯的保留時間分別為：5.7、9.7、17.3、18.5 min。根據(jù)色譜圖中4個峰的相關參數(shù)計算系統(tǒng)適用性，其理論塔板數(shù)均>3 000，相鄰峰的分離度均>1.5，脫尾因子在0.9～1.1的范圍內(nèi)。鹽酸苯海拉明的降解產(chǎn)物二苯酮不干擾其出峰?？瞻谆|、對照品以及樣品的色譜圖見圖1。

2.4.2線性關系

將“2.1”項下制備的系列混合對照品溶液按“2.3”項下色譜條件依次連續(xù)進樣，分別重復3次，以對照品溶液濃度(X,μg/ml)對峰面積(Y)進行線性回歸，呈良好的線性關系，見表1。

2.4.3定量限和檢測限

將3種對照品溶液進行逐級稀釋，以信噪比10∶1，確定其最低定量限；以信噪比3∶1，確定其最低檢測限。鹽酸苯海拉明、甲氧基肉桂酸辛酯、水楊酸辛酯的最低定量限分別為2.5、1.0、1.0 μg/ml；最低檢測限分別為1.0、0.4、0.4 μg/ml。

2.4.4精密度試驗

取“2.1”項下制備的混合對照品溶液中的第2、3、5三個點作為低、中、高3個濃度點，在1 d以內(nèi)連續(xù)進樣3次，以及連續(xù)3 d分別進樣，根據(jù)所得峰面積分別考察日內(nèi)和日間精密度。結果鹽酸苯海拉明的日內(nèi)和日間精密度RSD均 < 3.0%，甲氧基肉桂酸辛酯和水楊酸辛酯的日內(nèi)和日間精密度RSD均 < 2.0%，表明本方法的精密度良好。

圖1 多效防護霜的HPLC圖 A.對照品；B.供試品；C陰性對照：1.鹽酸苯海拉明；2.二苯酮；3.甲氧基肉桂酸辛酯；4.水楊酸辛酯

待測成分回歸方程線性范圍(μg/ml)r鹽酸苯海拉明Y= 0.394 1X -0.26995～1000.999 9甲氧基肉桂酸辛酯Y=0.382 2X+0.939 250～1 0000.999 9水楊酸辛酯Y=0.2351X+6.105 150～1 0000.999 5

2.4.5重復性試驗

精密稱取同一批次樣品1.0 g(批號：20180726)，共5份，按“2.2”項下方法分別制成樣品溶液，進樣分析。結果鹽酸苯海拉明、甲氧基肉桂酸辛酯、水楊酸辛酯的平均含量和RSD分別為1.88 mg/g(RSD = 0.55%)、71.93 mg/g(RSD = 0.27%)、48.94 mg/g(RSD = 0.25%)，表明本方法的重復性良好。

2.4.6穩(wěn)定性試驗

取按“2.2”項下方法新制備的樣品溶液(批號：20180726)，分別在0、1、2、4、8、12、24 h測定3種成分的峰面積，考察穩(wěn)定性，結果鹽酸苯海拉明、甲氧基肉桂酸辛酯、水楊酸辛酯的峰面積RSD分別為3.53%、3.26%、2.88%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7加樣回收率試驗

精密稱取空白基質1.0 g，共9份，每3份為1組，按低、中、高3個水平分別加入對照品一定量(樣品中各成分含量的80%、100%、120%)，按“2.2”項下方法制備，進樣分析，結果見表2。鹽酸苯海拉明、甲氧基肉桂酸辛酯、水楊酸辛酯的低、中、高濃度的平均回收率均在93%～104%，表明以本法同時測定多效防護霜中3種成分的回收率良好。

表2 加樣回收率試驗結果

2.4.8耐用性試驗

考察4個因素的微小改變對試驗結果的影響，包括不同流速(0.9、1.0、1.1 ml/min)，流動相中初始甲醇比例(58%、60%、62%)，柱溫(22℃、25℃、28℃)，檢測波長(217、218、219 nm)。結果顯示，3種成分的峰面積及保留時間的RSD均< 10%，分離度和拖尾因子等系統(tǒng)適用性參數(shù)均符合方法學要求，證明方法的耐用性良好。

2.5 樣品測定

按“2.2”項下方法制備3個批次的樣品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣分析，計算樣品中鹽酸苯海拉明、甲氧基肉桂酸辛酯、水楊酸辛酯的含量，結果見表3。

表3 三批樣品含量測定結果

3 討論

3.1 提取方法的優(yōu)化

本研究根據(jù)乳膏劑的特性，選擇了提取效率高，操作簡便的超聲提取法進行樣品前處理，對溶劑種類、溶劑體積、提取時間進行考察，最終選擇了甲醇50 ml，超聲提取20 min的方法。而后采用乙腈對于初提液進行二次提取，可以有效的除去樣品中的雜質，讓測定的專屬性更高。

3.2 色譜條件的選擇

對于流動相的選擇，本研究先后考察了甲醇-水、乙腈-水-三乙胺、甲醇-磷酸鹽緩沖液、甲醇-乙酸銨緩沖液。其中，甲醇-磷酸鹽緩沖液條件下，3種成分峰形佳，出峰時間短，但專屬性考察，鹽酸苯海拉明始終存在無法與雜峰分開的問題，換用甲醇-乙酸銨緩沖液后，通過pH調(diào)節(jié)，最終獲得了較好的分離度，因此選為流動相。對于檢測波長的選擇，中國藥典2015版第二部中鹽酸苯海拉明的檢測波長為258 nm，通過預實驗發(fā)現(xiàn)，鹽酸苯海拉明在258 nm處紫外吸收較弱，選用該波長對于鹽酸苯海拉明含量的測定靈敏度低。而在肩峰218 nm處鹽酸苯海拉明有較好的紫外吸收，兩種防曬劑甲氧基肉桂酸辛酯和水楊酸辛酯也有較好響應，因此選為最佳檢測波長(圖2)。對于色譜柱的選擇，本研究考察了安捷倫、沃特世和資生堂3個品牌的色譜柱，最終選擇了安捷倫Extend-C18柱。在pH偏堿性環(huán)境下，3個待測成分在該柱上分離度好，峰形佳，所以確定為最佳色譜柱。

圖2 紫外波長掃描圖 A.鹽酸苯海拉明；B.甲氧基肉桂酸辛酯；C.水楊酸辛酯

3.3 含量測定結果分析

3個批次的多效防護霜均為實驗室自制，測定結果可以看出，不同批次的樣品中鹽酸苯海拉明、甲氧基肉桂酸辛酯和水楊酸辛酯的含量有一定波動，這提示我們在進行中試放大生產(chǎn)時，要充分考慮各因素的影響，保證制劑中主要成分的含量穩(wěn)定，同時對霜劑的長期穩(wěn)定性也需要進行考察。

本研究建立了HPLC同時測定多效防護霜中鹽酸苯海拉明、甲氧基肉桂酸辛酯和水楊酸辛酯的含量的方法。經(jīng)全面的方法學驗證，成功應用于3個批次樣品中3種成分的測定，該法簡便可靠，可為多效防護霜的質量控制提供依據(jù)，也為其質量標準研究奠定了基礎。