金錢(qián)魚(yú)鰓細(xì)胞系的建立及其生長(zhǎng)特性的初步研究

周佳楠, 蘇冒亮, 張俊彬,2

海洋生物學(xué)

金錢(qián)魚(yú)鰓細(xì)胞系的建立及其生長(zhǎng)特性的初步研究

周佳楠1, 蘇冒亮2, 3, 張俊彬1,2

1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 上海 201306;2. 深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 深圳大學(xué)生命科學(xué)與海洋學(xué)院, 廣東 深圳 518060; 3.光電子器件與系統(tǒng)教育部和廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 深圳大學(xué)光電工程學(xué)院, 廣東 深圳 518060

鰓是魚(yú)類(lèi)滲透壓調(diào)節(jié)的主要器官, 鰓細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)的建立可以為魚(yú)類(lèi)滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)理研究提供重要的實(shí)驗(yàn)手段和研究方法。金錢(qián)魚(yú)()作為一種廣鹽性魚(yú)類(lèi), 是研究滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制的理想動(dòng)物模型。本研究采用胰蛋白酶消化法進(jìn)行了金錢(qián)魚(yú)鰓細(xì)胞的體外培養(yǎng), 確定該類(lèi)細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng)的最優(yōu)條件, 分析了其生長(zhǎng)特性。結(jié)果表明, 金錢(qián)魚(yú)鰓細(xì)胞系在28℃, 含有20%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的L-15培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最佳, 2~4d即可傳代, 傳代后可穩(wěn)定培養(yǎng), 命名為SG。在傳代培養(yǎng)過(guò)程中, 對(duì)其增殖情況進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)SG細(xì)胞群體倍增時(shí)間為40.8h。正常傳代的SG細(xì)胞凍存、復(fù)蘇后, 經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)得細(xì)胞存活率約為87%。鰓細(xì)胞直接同水體環(huán)境接觸, 具有高效的滲透壓調(diào)節(jié)能力。環(huán)境鹽度變化時(shí), 鰓細(xì)胞啟動(dòng)滲透壓脅迫應(yīng)答機(jī)制, 維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。本研究對(duì)SG細(xì)胞進(jìn)行滲透壓刺激后, 檢測(cè)其增殖情況并觀察形態(tài)變化。分析表明, SG細(xì)胞在分別為150和600mOsmol·kg–1的低滲和高滲脅迫后均可增殖, 且低滲脅迫后的增殖速度是高滲脅迫的1.5倍。滲透壓脅迫后SG細(xì)胞的形態(tài)觀察結(jié)果顯示, 低滲培養(yǎng)基脅迫后細(xì)胞體積發(fā)生膨脹而高滲條件下細(xì)胞體積發(fā)生皺縮。由此推斷SG細(xì)胞具有較強(qiáng)滲透壓耐受性, 且低滲耐受能力強(qiáng)于高滲。SG細(xì)胞系的建立為金錢(qián)魚(yú)滲透壓應(yīng)答機(jī)制和相關(guān)基因功能的研究提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)材料。

金錢(qián)魚(yú); 鰓細(xì)胞系; 原代培養(yǎng); 傳代培養(yǎng)

與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比, 魚(yú)類(lèi)細(xì)胞不需要頻繁的傳代以保持細(xì)胞活力, 且具有耐溫范圍廣、取材廣泛等特點(diǎn)(張博等, 2011), 被廣泛用于免疫學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)和功能基因組學(xué)等研究(Laing et al, 2011; Skrzypski et al, 2016; 張永德等, 2018)。近年來(lái), 以魚(yú)類(lèi)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的研究發(fā)展迅速, 主要涉及腎臟、肝臟等組織的細(xì)胞系(Lai et al, 2003; 樊廷俊等, 2010; Abdul Majeed et al, 2013; Xue et al, 2018)。魚(yú)鰓細(xì)胞具有較強(qiáng)的有絲分裂能力, 并不會(huì)受魚(yú)體成年的影響, 是細(xì)胞培養(yǎng)的良好材料(張博等, 2011)。鰓細(xì)胞直接同水體環(huán)境接觸, 當(dāng)水體鹽度發(fā)生變化時(shí), 鰓細(xì)胞是參與滲透壓調(diào)節(jié), 維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的主要細(xì)胞類(lèi)型。有研究者將虹鱒()鰓原代細(xì)胞暴露在低滲環(huán)境中, 發(fā)現(xiàn)鰓細(xì)胞可以通過(guò)調(diào)節(jié)自我體積以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)(McCarty et al, 1992; Leguen et al, 1998; Wehner et al, 2003)。鰓細(xì)胞是魚(yú)體內(nèi)參與滲透壓調(diào)控的主要功能細(xì)胞, 鰓細(xì)胞系的建立可有助于從細(xì)胞水平上更清楚的了解魚(yú)類(lèi)的滲透壓脅迫應(yīng)答機(jī)制。但由于魚(yú)類(lèi)的鰓細(xì)胞直接暴露于水生環(huán)境中, 鰓表面有細(xì)菌等污染物, 因此, 鰓細(xì)胞系的建立有一定的技術(shù)難度。

魚(yú)類(lèi)細(xì)胞分離常用的方法有胰蛋白酶消化法和組織塊遷出法。組織塊遷出法分離到的細(xì)胞完整性較好, 但細(xì)胞遷出時(shí)間較長(zhǎng)。胰蛋白酶消化法操作簡(jiǎn)單, 獲得細(xì)胞量較多, 細(xì)胞增殖速度也較組織塊遷出法更快(王彬等, 2010)。細(xì)胞遷出后需足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和適宜的培養(yǎng)條件才可正常貼壁和生長(zhǎng)。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)中的活性蛋白和一些未知因子是維持細(xì)胞生長(zhǎng)的重要物質(zhì)(王夢(mèng)珣 等, 2018)。在細(xì)胞培養(yǎng)中, 溫度也是影響其生長(zhǎng)和增殖的主要環(huán)境因子, 培養(yǎng)溫度的變化可能會(huì)影響細(xì)胞代謝等生理活動(dòng)從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖速度發(fā)生變化。已報(bào)道的通過(guò)胰蛋白酶消化法和組織塊遷出法獲得細(xì)胞并傳代培養(yǎng)的魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系有非洲鯰魚(yú)()卵巢細(xì)胞系(Kumar et al, 2001)、虹鱒()皮膚細(xì)胞系(Ossum et al, 2004)、石斑魚(yú)()腦細(xì)胞系(Ku et al, 2009)以及金錢(qián)魚(yú)()腎臟細(xì)胞系(張瑩瑩等, 2014)等。

金錢(qián)魚(yú)隸屬于鱸形目Perciformes, 金錢(qián)魚(yú)科Scatophagidae, 金錢(qián)魚(yú)屬, 主要分布于印度—太平洋海域。在我國(guó), 金錢(qián)魚(yú)主要分布于東南沿海, 是一種優(yōu)質(zhì)海水魚(yú)養(yǎng)殖品種, 具有較強(qiáng)的滲透壓調(diào)節(jié)能力, 是研究滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制的良好模型(Su et al, 2016)。本研究旨在建立金錢(qián)魚(yú)鰓細(xì)胞系, 確定其最適培養(yǎng)條件及生長(zhǎng)特性, 為金錢(qián)魚(yú)滲透壓脅迫應(yīng)答機(jī)制和基因功能等的研究提供平行性好、可精準(zhǔn)控制條件的實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

金錢(qián)魚(yú)(體重為40.6±3.4g)購(gòu)自廣東省湛江市, 于25‰鹽度的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)4周, 水溫維持在28±1℃。早晚各投喂一次, 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前兩天停止喂食。L-15培養(yǎng)基(Leibovitz's L-15 Medium, L-15)和0.25%胰酶-EDTA購(gòu)自Thermo Scientific公司; 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購(gòu)自Gibco BRL公司; 雙抗(青霉素、鏈霉素)、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)購(gòu)自Sigma公司。膠回收試劑盒購(gòu)自Takara公司, pGEM-T Easy載體購(gòu)自Promega公司, Cell Counting Kit-8/CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)基的配制

原代培養(yǎng)基為含20%FBS和400U雙抗的L-15培養(yǎng)基, 傳代培養(yǎng)使用含10%FBS的L-15培養(yǎng)基。配制低滲(150mOsmol·kg–1)、等滲(300mOsmol·kg–1)和高滲(600mOsmol·kg–1)培養(yǎng)基。具體方法為, 在L-15培養(yǎng)基中加入無(wú)菌飽和NaCl和ddH2O, 測(cè)定培養(yǎng)基滲透壓(誤差＜2mOsmol·kg–1)最后加入終濃度為10%的FBS, 備用。

1.2.2 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)

取一尾狀態(tài)良好的金錢(qián)魚(yú), 先將整尾魚(yú)放入75%酒精中浸泡30s、抽血后無(wú)菌解剖取出鰓組織, 用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)沖洗鰓組織5次后75%酒精沖洗1次, 再用含400U雙抗的PBS沖洗7~8次。去除殘留血液。將鰓組織剪碎至1mm3大小, 放入15mL離心管中, 加入0.25%胰酶-EDTA于28℃培養(yǎng)箱中消化30min后終止消化。經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾, 獲得的細(xì)胞懸液1000×g室溫離心10min, 棄上清。加入培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞沉淀, 接種至25cm2培養(yǎng)瓶, 28℃培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后逐步更換培養(yǎng)基, 梯度降低雙抗?jié)舛? 細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí), 完全去除雙抗。

細(xì)胞鋪滿瓶底后, 棄培養(yǎng)基加入500μL 0.25%胰酶-EDTA消化細(xì)胞, 待細(xì)胞脫壁后, 加入20%FBS的L-15終止消化。吹打混勻細(xì)胞, 1︰2或1︰3比例傳代培養(yǎng)。

1.2.3 最適體外培養(yǎng)條件的確定

為確定鰓細(xì)胞體外培養(yǎng)的最適FBS濃度, 取第9代鰓細(xì)胞, 胰酶消化后經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。按照CCK-8說(shuō)明書(shū), 細(xì)胞以5000cells·100μL–1的密度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。共接種5塊板, 每板6組, 每組5個(gè)復(fù)孔, 一個(gè)空白對(duì)照。待細(xì)胞貼壁后以板為單位棄去原培養(yǎng)基分別更換為含0、5%、10%、15%、20%和25%FBS的L-15培養(yǎng)基, 28℃繼續(xù)培養(yǎng)。每天每個(gè)濃度各選一組細(xì)胞加入10μL CCK-8, 孵育24h后, Synergy H4全功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek)檢測(cè)光密度(optical density, OD), 檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm。實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行6d。

為確定鰓細(xì)胞體外培養(yǎng)的最適溫度, 采用上述方法接板。待細(xì)胞貼壁后, 分別放到溫度為20、24、28、32和36℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每天取每塊板的一組加入10μL CCK-8, 孵育24h后, 檢測(cè)光密度(方法同上)。實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行6d。

1.2.4 細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線繪制

細(xì)胞接板方法同上, 待細(xì)胞貼壁后以板為單位棄去原培養(yǎng)基更換為含20% FBS的L-15培養(yǎng)基, 28℃繼續(xù)培養(yǎng)。每天取一組加入10μL CCK-8, 孵育24h后, 酶標(biāo)儀450nm處檢測(cè)光密度, 實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行7d。根據(jù)公式=×lg2/lg(N/N0), 計(jì)算細(xì)胞系的群體倍增時(shí)間(), 其中0為起始接種的細(xì)胞數(shù),N為培養(yǎng)時(shí)間后的細(xì)胞數(shù)(Fan et al, 2007)。

1.2.5 細(xì)胞系的分子生物學(xué)鑒定

采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA。加1mL Trizol冰上裂解細(xì)胞5min, 加入200μL氯仿異戊醇, 劇烈搖晃30s后靜置2min, 離心。取上清液, 1:1加入異丙醇, 混勻后靜置10min, 離心棄去上清。用1mL 75%酒精清洗沉淀的RNA, 棄去酒精, 無(wú)菌風(fēng)吹干沉淀, 加DEPC水溶解RNA。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000(Thermo Scientific)進(jìn)行RNA完整性和濃度、純度的測(cè)定。取1μg RNA, 以O(shè)ligo d(T)16作為接頭引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, –20℃保存產(chǎn)物。

普通PCR擴(kuò)增金錢(qián)魚(yú)鰓細(xì)胞和鰓組織18S rRNA基因。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取18S rRNA基因序列。利用Premier 5.0設(shè)計(jì)引物, 由生工生物工程(上海)合成。引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增體系(50μL): (NH4)2SO4Buffer 5μL, Mg2+5μL, dNTP(10mmol·L–1) 2μL, cDNA 2μL, 引物(10pmol)各1μL, Taq酶0.6μL, ddH2O 33.4μL。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性2min, 94℃變性35s, 55℃退火40s, 35個(gè)循環(huán), 72℃延伸1min, 72℃后延伸10min, 4℃保存。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物, 通過(guò)膠回收試劑盒回收目的片段, 連接至pGEM-T Easy載體, 并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中, 挑選單克隆菌落送測(cè)(生工生物,上海), 利用NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)分析, 確定細(xì)胞系來(lái)源。

表1 引物序列

1.2.6 凍存與復(fù)蘇

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鰓細(xì)胞, 胰蛋白酶消化后加入培養(yǎng)基重懸, 離心棄上清。加入1mL凍存液(凍存液: 20% FBS、10%DMSO和70% L-15培養(yǎng)基)吹打混勻, 轉(zhuǎn)移至凍存管, 放入細(xì)胞凍存盒, –80℃冰箱過(guò)夜, 液氮中長(zhǎng)期保存。

液氮罐中取出凍存的第9代鰓細(xì)胞, 迅速放入40±2℃溫水中, 融化后將細(xì)胞液移入15mL離心管中, 加入10倍體積的L-15培養(yǎng)基, 離心后棄液體, 加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后, 接種至培養(yǎng)瓶。

細(xì)胞復(fù)蘇時(shí), 取少量細(xì)胞懸液, 按照細(xì)胞懸液: 0.4%臺(tái)盼藍(lán)以9︰1的比例染色5min, 死細(xì)胞將被染成藍(lán)色, 活細(xì)胞無(wú)色, 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后計(jì)算細(xì)胞成活率。染色和計(jì)數(shù)分別重復(fù)3次。

1.2.7 金錢(qián)魚(yú)鰓細(xì)胞滲透壓耐受性測(cè)定

取第9代鰓細(xì)胞, 經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后接板培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后更換低滲、等滲和高滲培養(yǎng)基, 分別孵育5min、10min、30min、1h、3h、6h、12h、24h和48h然后每孔加入10μL CCK-8試劑, 于24h后測(cè)定光密度。分析鰓細(xì)胞在不同滲透壓培養(yǎng)基脅迫后細(xì)胞增殖的變化情況。

觀察SG細(xì)胞在不同滲透壓的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3h后, 細(xì)胞形態(tài)的變化。取第9代鰓細(xì)胞, 經(jīng)胰酶消化、培養(yǎng)基重懸后接種到六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 共5組, 每組3個(gè)復(fù)孔。待SG細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí), 棄液體, 加入不同滲透壓的培養(yǎng)基, 刺激培養(yǎng)3h后觀察細(xì)胞形態(tài)、拍照。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)

本研究采用胰蛋白酶消化法成功分離金錢(qián)魚(yú)鰓細(xì)胞, 建立細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。原代培養(yǎng)第6d觀察到細(xì)胞貼壁(圖1a), 第13d細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面(圖1b), 主要為上皮樣細(xì)胞。SG細(xì)胞間存在接觸抑制, 無(wú)重疊生長(zhǎng)。原代培養(yǎng)周期為13d。原代細(xì)胞匯合度達(dá)到80%即可按照1:1的比例進(jìn)行首次傳代。首次傳代后, 細(xì)胞增殖速率加快, 5d后可再次進(jìn)行傳代, 10代后傳代周期穩(wěn)定為2~4d。

圖1 SG細(xì)胞系原代培養(yǎng)

a. 原代培養(yǎng)第6d鰓細(xì)胞貼壁; b. 原代培養(yǎng)第13d鰓細(xì)胞鋪滿瓶底

Fig. 1 Primary culture of SG cells. a) Adhesion of branchial cells on the 6th day of primary culture; b) Branchial cells covered with bottle bottom on the 13th day of primary culture.

2.2 最適體外培養(yǎng)條件的確定

對(duì)不同F(xiàn)BS濃度培養(yǎng)的SG細(xì)胞增殖情況進(jìn)行分析, 結(jié)果表明, 如圖2所示SG細(xì)胞在FBS濃度為0和25%時(shí)細(xì)胞均無(wú)法增殖; 5%~20%范圍內(nèi)FBS濃度和細(xì)胞增殖速度成正比; 20%和5%相比, 每天的增殖速度都要快150%以上, 培養(yǎng)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束(第6d), 20%組是5%組細(xì)胞量的200%。因此, SG細(xì)胞的最適FBS培養(yǎng)濃度為20%。

圖 2 不同F(xiàn)BS濃度對(duì)SG細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

分析對(duì)不同溫度培養(yǎng)的SG細(xì)胞的增殖情況發(fā)現(xiàn), 如圖3所示, SG細(xì)胞的耐溫范圍較廣, 在20~ 36℃范圍內(nèi)均可增殖。32℃和36℃培養(yǎng)細(xì)胞時(shí), 細(xì)胞增殖較快同時(shí)老化也很快, 細(xì)胞狀態(tài)不佳; 細(xì)胞在20℃培養(yǎng)6d細(xì)胞量?jī)H增加1.3倍, 增殖速度最慢; 24℃時(shí)細(xì)胞前4d增殖較慢, 4d后增殖速度顯著加快, 第6d細(xì)胞量增加3倍; 28℃培養(yǎng)的細(xì)胞增殖較快, 呈穩(wěn)定上升趨勢(shì)且細(xì)胞狀態(tài)較好, 培養(yǎng)第6d細(xì)胞數(shù)達(dá)到最多, 達(dá)到了初始接種細(xì)胞數(shù)的4倍。

圖3 不同溫度對(duì)SG細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.3 細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線繪制

從生長(zhǎng)曲線(圖4)可以看出, SG細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的前2d屬于細(xì)胞生長(zhǎng)遲緩期, 2d后進(jìn)入SG細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 第4d開(kāi)始進(jìn)入平緩期。SG細(xì)胞在第6d進(jìn)入生長(zhǎng)的衰退期。SG細(xì)胞的群體倍增時(shí)間為40.8h。

圖4 SG細(xì)胞系的生長(zhǎng)曲線

Ⅰ: 遲緩期; Ⅱ: 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期; Ⅲ: 平緩期; Ⅳ: 衰退期

Fig. 4 Growth curve of SG cells. Ⅰ: Lag phase; Ⅱ: Logarithmic phase; Ⅲ: Stationary phase; Ⅳ: Decline phase

2.4 細(xì)胞系來(lái)源鑒定

通過(guò)擴(kuò)增金錢(qián)魚(yú)鰓細(xì)胞系18S rRNA與金錢(qián)魚(yú)鰓組織中18S rRNA基因并比較其同源性來(lái)確定細(xì)胞系來(lái)源。18S rRNA擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為819bp, 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示為單一條帶。對(duì)測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)序列相似度為99.7%, 確定此細(xì)胞系來(lái)源于金錢(qián)魚(yú)(圖5)。

圖5 18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

泳道1, Maker為DL2000; 泳道2: SG細(xì)胞; 泳道3: 鰓組織

Fig. 5 The result of amplification 18S rRNA.Line 1: Maker: DL2000; Lane 2: SG; Lane 3: gill

2.5 凍存和復(fù)蘇

復(fù)蘇凍存的第9代鰓細(xì)胞, 通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色后測(cè)得細(xì)胞存活率約為87%。細(xì)胞復(fù)蘇后6h貼壁, 4d后鋪滿培養(yǎng)瓶底部。復(fù)蘇后細(xì)胞形態(tài)正常, 傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)正常。

2.6 不同滲透壓刺激后細(xì)胞增殖測(cè)定

SG細(xì)胞在不同滲透壓脅迫下的增殖情況如圖6所示, SG細(xì)胞在低滲和高滲脅迫條件下均可增殖, 低滲脅迫的48h內(nèi)細(xì)胞增殖十分緩慢, 低滲脅迫的前期增殖較慢, 3h后細(xì)胞增殖顯著加快, 12h增殖最快, 為初始脅迫細(xì)胞量的1.5倍。滲透壓脅迫后的6h內(nèi)低滲細(xì)胞狀態(tài)略遜于高滲細(xì)胞, 但之后細(xì)胞狀態(tài)顯著優(yōu)于高滲脅迫的細(xì)胞。

圖 6 不同滲透壓條件對(duì)SG細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

SG細(xì)胞在不同滲透壓培養(yǎng)基刺激3h后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。滲透壓為150mOsmol·kg–1的低滲培養(yǎng)基刺激細(xì)胞3h后觀察細(xì)胞形態(tài), 結(jié)果表明較正常培養(yǎng)的細(xì)胞(圖7b), 低滲刺激后SG細(xì)胞體積膨脹(圖7a)。而滲透壓為600mOsmol·kg–1的高滲培養(yǎng)基刺激細(xì)胞3h后與對(duì)照組相比, SG細(xì)胞體積明顯皺縮(圖7c)。

3 討論

魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)具有取材廣泛、便于觀察和檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn), 常被用于基因生理功能的體外驗(yàn)證。自草魚(yú)(Duranton et al, 1997)鰓組織中成功分離并建立鰓細(xì)胞系后, 牙鲆()(李宏等, 1997)、文昌魚(yú)()(石松林等, 2009)和圓斑星鰈()(樊廷俊等, 2010)等魚(yú)類(lèi)的鰓細(xì)胞系也陸續(xù)建立, 但對(duì)鰓細(xì)胞生長(zhǎng)特性的研究較少。本研究成功建立了金錢(qián)魚(yú)鰓細(xì)胞系, 并確定其最適培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)特性, 為金錢(qián)魚(yú)滲透壓脅迫應(yīng)答機(jī)制的研究提供理想實(shí)驗(yàn)材料。

圖7 不同滲透壓刺激后的金錢(qián)魚(yú)鰓細(xì)胞(20×)

a. 低滲(150mOsmol·kg–1)刺激3h后的SG細(xì)胞; b. 等滲(300mOsmol·kg–1)培養(yǎng)3h的SG細(xì)胞; c.高滲(600mOsmol·kg–1)刺激3h后的SG細(xì)胞

Fig. 7 SG cells after osmotic stimulation. a. SG stimulated by hypoosmosis (150 mOsmol·kg–1) for 3h; b. SG cultured at 300 mOsmol·kg–1for 3h; c. SG stimulated by hyperosmosis (600 mOsmol·kg–1) for 3h

鰓組織直接暴露在水體環(huán)境中, 表面粘液較多, 易粘附水體中的細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等污染物, 如何除去鰓組織表面污染物的同時(shí)還要保證細(xì)胞活性是鰓細(xì)胞系建立的關(guān)鍵步驟。本研究首先用75%酒精對(duì)整尾魚(yú)進(jìn)行短暫消毒, 去除表面細(xì)菌等污染物。取出的鰓組織用PBS和75%酒精交替沖洗, 嚴(yán)格控制每個(gè)環(huán)節(jié)的時(shí)間(PBS和75%酒精每次均沖洗1min), 避免損傷鰓細(xì)胞的同時(shí)有效清洗組織表面污染物和殘留血液。本研究采用胰蛋白酶消化法建立SG細(xì)胞的原代培養(yǎng)體系, 將鰓組織沖洗干凈后剪成小塊放入胰蛋白酶中消化, 獲得的原代細(xì)胞接種至培養(yǎng)瓶中。觀察發(fā)現(xiàn), 本研究所用的原代細(xì)胞獲取方法, 避免了組織塊遷出法中對(duì)分離出的原代細(xì)胞的機(jī)械損傷, 且細(xì)胞狀態(tài)好, 數(shù)量多(Nathiga Nambi et al, 2017)。原代培養(yǎng)第6d鰓細(xì)胞開(kāi)始貼壁, 第13d即可傳代, 傳代間隔時(shí)間為5d。觀察斑馬魚(yú)()視網(wǎng)膜色素細(xì)胞、石斑魚(yú)()腦細(xì)胞、大西洋鮭魚(yú)()鰓細(xì)胞等上皮樣細(xì)胞的形態(tài)(Wen et al, 2008; Nambi et al, 2015; Gjessing et al, 2018), 結(jié)合本文的圖1b、圖7b, 我們推測(cè)本研究分離出的鰓細(xì)胞主要為上皮樣細(xì)胞。SG細(xì)胞培養(yǎng)中用L-15培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基, 該培養(yǎng)基用半乳糖代替葡萄糖, 具有穩(wěn)定的磷酸鹽緩沖體系, 是魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用最廣泛的培養(yǎng)基(Fan et al, 2010; Lakra et al, 2011)。以往研究也表明, L-15也是金錢(qián)魚(yú)腎臟細(xì)胞培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基(張瑩瑩等, 2014)。魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)中, 培養(yǎng)基僅提供基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通常還需FBS等添加物, 提供細(xì)胞離體存活所需的未知因子等物質(zhì), 促進(jìn)細(xì)胞貼壁和增殖。細(xì)胞傳代培養(yǎng)中, FBS提供的蛋白酶抑制劑, 可以保護(hù)細(xì)胞不受剩余蛋白酶的消化(Zhu et al, 2013;王夢(mèng)珣等, 2018)。本實(shí)驗(yàn)在L-15培養(yǎng)基中加入0、5%、10%、15%和20%的FBS, 觀察其增殖情況發(fā)現(xiàn), 細(xì)胞培養(yǎng)中FBS濃度為25%時(shí)SG細(xì)胞不增殖, 這可能是由于高濃度血清產(chǎn)生的代謝物較多, 從而抑制細(xì)胞增殖(Wang et al, 2010; Zhang et al, 2011;王英英等, 2017)。當(dāng)不添加FBS時(shí)培養(yǎng)SG細(xì)胞6天, 細(xì)胞都未增殖, 說(shuō)明FBS是SG細(xì)胞增殖所必須添加物。在含有20%FBS的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)SG細(xì)胞的增殖速度快于5%、10%和15%FBS培養(yǎng)的細(xì)胞, 因此SG細(xì)胞的最適血清濃度為20%。

溫度是影響細(xì)胞體外培養(yǎng)的重要環(huán)境因子之一。與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比, 魚(yú)類(lèi)細(xì)胞的耐溫范圍較廣。本文通過(guò)對(duì)比20、24、28、32和36℃五種溫度下SG細(xì)胞的增殖情況, 發(fā)現(xiàn)20~36℃范圍內(nèi)SG細(xì)胞均可增殖。在36℃培養(yǎng)時(shí), 推測(cè)是溫度過(guò)高抑制酶的活性(劉肖峰, 2015), 導(dǎo)致SG細(xì)胞從2d后增殖十分緩慢。32℃培養(yǎng)的SG細(xì)胞前期受溫度影響較小, 但隨著細(xì)胞數(shù)目的增加, 影響逐漸顯著、增殖速度逐漸降低、培養(yǎng)的第5d細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)死亡。培養(yǎng)溫度較低時(shí)(20℃和24℃), 細(xì)胞代謝速度的降低(劉肖峰, 2015), 導(dǎo)致SG細(xì)胞增殖減慢。

鰓細(xì)胞是參與滲透壓調(diào)控的主要細(xì)胞類(lèi)型, 虹鱒鰓細(xì)胞的滲透壓耐受范圍為175~550mOsmol·kg–1(Lee et al, 2009)。本研究發(fā)現(xiàn)SG細(xì)胞在150和600mOsmol·kg–1滲透壓脅迫后均可生長(zhǎng), 說(shuō)明其具有較強(qiáng)的滲透壓耐受性。SG細(xì)胞在低滲脅迫的短時(shí)間內(nèi)(3h)可能無(wú)法維持體內(nèi)滲透壓的穩(wěn)定, 出現(xiàn)少量死亡, 待體內(nèi)滲透壓穩(wěn)定后, SG細(xì)胞開(kāi)始增殖。高滲脅迫后的48h內(nèi)SG細(xì)胞增殖十分緩慢, 說(shuō)明高滲脅迫對(duì)SG細(xì)胞的影響很大, SG細(xì)胞在維持體內(nèi)滲透壓穩(wěn)定平衡的前提下, 很難生長(zhǎng)。分析滲透壓脅迫3h后SG細(xì)胞的增殖情況發(fā)現(xiàn), SG細(xì)胞在低滲中的增殖速度是高滲脅迫的1.5倍, 表明SG細(xì)胞的低滲耐受力優(yōu)于高滲。低滲脅迫培養(yǎng)SG細(xì)胞3h后體積發(fā)生明顯膨脹, 高滲脅迫條件下SG細(xì)胞體積發(fā)生明顯皺縮, 而離子的跨膜運(yùn)輸是引起細(xì)胞體積變化的主要原因(Fisher et al, 1984; Verbalis et al, 1991; Lang et al, 1998)。為避免細(xì)胞體積變化較大, 細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)大量跨膜運(yùn)輸和代謝等機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié), 這些機(jī)制不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞體積的變化, 也影響細(xì)胞的功能調(diào)控(Lang et al, 1998), 因此細(xì)胞體積的變化是細(xì)胞滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制中調(diào)節(jié)細(xì)胞性能的一個(gè)重要元素。

本研究采用胰蛋白酶消化法成功從金錢(qián)魚(yú)鰓組織中獲取SG原代細(xì)胞。研究表明, SG細(xì)胞培養(yǎng)的最適FBS濃度為20%, 28℃為該細(xì)胞的最適培養(yǎng)溫度, 細(xì)胞的群體倍增時(shí)間為40.8h。對(duì)SG細(xì)胞的生長(zhǎng)特性分析發(fā)現(xiàn), 其在低滲和高滲脅迫后均可生長(zhǎng), 具有較強(qiáng)的滲透壓耐受能力, 且低滲脅迫下的增殖速度是高滲脅迫的1.5倍。SG細(xì)胞系的建立為魚(yú)類(lèi)滲透壓脅迫應(yīng)答機(jī)制的研究提供理想實(shí)驗(yàn)材料。

樊廷俊, 郭雪陽(yáng), 姜國(guó)建, 等, 2010. 圓斑星鰈連續(xù)性鰓細(xì)胞系的建立[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 40(9): 69–74. FAN TINGJUN, GUO XUEYANG, JIANG GUOJIAN, et al, 2010. Establishment of a continuous gill cell line from spotted halibut,[J]. Periodical of Ocean University of China, 40(9): 69–74 (in Chinese with English abstract).

李宏, 童裳亮, 1997. 牙鲆的組織培養(yǎng)與鰓細(xì)胞系的獲得[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 21(2): 193–196. LI HONG, TONG SHANGLIANG, 1997. The tissue culture ofand the derivation of gill cell line[J]. Journal of Fisheries of China, 21(2): 193–196 (in Chinese with English abstract).

劉肖峰, 2015. 云紋石斑魚(yú)細(xì)胞系的建立及初步應(yīng)用研究[D]. 青島: 中國(guó)海洋大學(xué): 1–64. LIU XIAOFENG, 2015. Establishment and premilinary applications of cell lines from[D]. Qingdao: Ocean University of China: 1–64 (in Chinese with English abstract).

石松林, 黃曉明, 李祺福, 等, 2009. 文昌魚(yú)鰓組織原代培養(yǎng)[J]. 海洋科學(xué), 33(3): 44–48. SHI SONGLIN, HUANG XIAOMING, LI QIFU, et al, 2009. Primary cell culture from gill explants of amphioxus[J]. Marine Sciences, 33(3): 44–48 (in Chinese with English abstract).

王彬, 張其中, 2010. 近江牡蠣鰓細(xì)胞的原代培養(yǎng)[J]. 海洋科學(xué), 34(6): 1–5, 21. WANG BIN, ZHANG QIZHONG, 2010. Primary culture of oyster () gill cell[J]. Marine Sciences, 34(6): 1–5, 21 (in Chinese with English abstract).

王夢(mèng)珣, 朱鶴, 王玉玨, 等, 2018. 斑石鯛肌肉、腦細(xì)胞系的建立與生物學(xué)特性[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 48(6): 67–74. WANG MENGXUN, ZHU HE, WANG YUJUE, et al, 2018. Establishment and Characterization of two cell lines derived from Spotted Knifejawmuscle and brain[J]. Periodical of Ocean University of China, 48(6): 67–74 (in Chinese with English abstract).

王英英, 曾偉偉, 李瑩瑩, 等, 2017. 錦鯉腦細(xì)胞系建立和應(yīng)用[J]. 珠江水產(chǎn)科學(xué), (4): 24–33. WANG YINGYING, ZENG WEIWEI, LI YINGYING, et al, 2017. Development and application of a cell line from the brain of koi ()[J]. Pearl River Fisheries Science, (4): 24–33 (in Chinese with English abstract).

張博, 陳松林, 2011. 近10年魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)研究進(jìn)展及應(yīng)用展望[J]. 海洋科學(xué), 35(7): 113–121. ZHANG BO, CHEN SONGLIN, 2011. Decades of researching progresses of fish cell culture and its application prospects[J]. Marine Sciences, 35(7): 113–121 (in Chinese with English abstract).

張永德, 潘傳燕, 余艷玲, 等, 2018. 永生化尼羅羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞系的建立及鑒定[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 42(3): 376–387. ZHANG YONGDE, PAN CHUANYAN, YU YANLIN, et al, 2018. Establishment and identification of immortalized macrophage cell line of tilapia ()[J]. Journal of Fisheries of China, 42(3): 376–387 (in Chinese with English abstract).

張瑩瑩, 梁雪梅, 曾文剛, 等, 2014. 金錢(qián)魚(yú)腎細(xì)胞系的建立及生長(zhǎng)特性研究[J]. 海洋與湖沼, 45(3): 651–656. ZHANG YINGYING, LIANG XUEMEI, ZENG WENGANG, et al, 2014. Establishment and characterization of a new euryhaline fish kidney cell line of Spotted Scat[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 45(3): 651–656 (in Chinese with English abstract).

ABDUL MAJEED S, NAMBI K S, TAJU G, et al, 2013. Establishment and characterization of permanent cell line from gill tissue of(Hamilton) and its application in gene expression and toxicology[J]. Cell Biology and Toxicology, 29(1): 59–73.

DURANTON C, TAUC M, AVELLA M, et al, 1997. Chloride channels in primary cultures of seawater fish () gill[J]. American Journal of Physiology, 273(3): C874–C882.

FAN TINGJUN, ZHAO JUN, FU YONGFENG, et al, 2007. Establishment of a novel corneal endothelial cell line from domestic rabbit,[J]. Science in China Series C: Life Sciences, 50(2): 161–169.

FAN TINGJUN, REN BINGXIN, GENG XIAOFEN, et al, 2010. Establishment of a turbot fin cell line and its susceptibility to turbot reddish body iridovirus[J]. Cytotechnology, 62(3): 217–223.

FISHER R S, SPRING K R, 1984. Intracellular activities during volume regulation by[J]. Molecular Membrane Biology, 78(3): 187–199.

GJESSING M C, AAMELFOT M, BATTS W N, et al, 2018. Development and characterization of two cell lines from gills of Atlantic salmon[J]. PLoS ONE, 13(2): e0191792.

KU CHENCHUN, TENG YUCHENG, WANG CHUNSHUN, et al, 2009. Establishment and characterization of three cell lines derived from the rockfish grouper: Use for transgenic studies and cytotoxicity testing[J]. Aquaculture, 294(1–2): 147–151.

KUMAR G S, SINGH I S B, PHILIP R, 2001. Development of a cell culture system from the ovarian tissue of African catfish ()[J]. Aquaculture, 194(1–2): 51–62.

LAI Y S, JOHN J A C, LIN C H, et al, 2003. Establishment of cell lines from a tropical grouper,(Temminck & Schlegel), and their susceptibility to grouper irido- and nodaviruses[J]. Journal of Fish Diseases, 26(1): 31–42.

LAING K J, HANSEN J D, 2011. Fish T cells: Recent advances through genomics[J]. Developmental and Comparative Immunology, 35(12): 1282–1295.

LAKRA W S, SWAMINATHAN T R, JOY K P, 2011. Development, characterization, conservation and storage of fish cell lines: A review[J]. Fish Physiology and Biochemistry, 37(1): 1–20.

LANG F, BUSCH G L, RITTER M, et al, 1998. Functional significance of cell volume regulatory mechanisms[J]. Physiological Reviews, 78(1): 247–306.

LEE L E J, DAYEH V R, SCHIRMER K, et al, 2009. Applications and potential uses of fish gill cell lines: Examples with RTgill-W1[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal, 45(3–4): 127–134.

LEGUEN I, PRUNET P, 1998. Effect of hypotonic shock on cell volume and intracellular calcium of trout gill cells[J]. Bulletin Francais de la Peche et de la Pisciculture, 350: 521–528.

MCCARTY N A, ONEIL R G, 1992. Calcium signaling in cell volume regulation[J]. Physiological Reviews, 72(4): 1037–1061.

NAMBI K S N, MAJEED S A, TAJU G, et al, 2015. Development and use of retinal pigmented epithelial cell line from Zebrafish () for evaluating the toxicity of ultraviolet-B[J]. Zebrafish, 12(1): 21–32.

NATHIGA NAMBI K S, ABDUL MAJEED S, TAJU G, et al, 2017. Effects of nicotine on zebrafish: A comparative response between a newly established gill cell line and whole gills[J]. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C: Toxicology & Pharmacology, 195: 68–77.

OSSUM C G, HOFFMANN E K, VIJAYAN M M, et al, 2004. Characterization of a novel fibroblast-like cell line from rainbow trout and responses to sublethal anoxia[J]. Journal of Fish Biology, 64(4): 1103–1116.

SKRZYPSKI M, KHAJAVI N, MERGLER S, et al, 2016. Orexin A modulates INS-1E cell proliferation and insulin secretion via extracellular signal-regulated kinase and transient receptor potential channels[J]. Journal of Physiology and Pharmacology, 67(5): 643–652.

SU MAOLIANG, HU PAN, ZHOU JIANAN, et al, 2016. Branchial transcriptional responses of spotted scat,, to acute hypo-osmotic stress[J]. Agri Gene, 1: 100–108.

VERBALIS J G, GULLANS S R, 1991. Hyponatremia causes large sustained reductions in brain content of multiple organic osmolytes in rats[J]. Brain Research, 567(2): 274–282.

WANG X L, WANG N, SHA Z X, et al, 2010. Establishment, characterization of a new cell line from heart of half smooth tongue sole ()[J]. Fish Physiology and Biochemistry, 36(4): 1181–1189.

WEHNER F, OLSEN H, TINEL H, et al, 2003. Cell volume regulation: osmolytes, osmolyte transport, and signal transduction[C]//Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology, vol. 148. Berlin, Heidelberg: Springer: 1–80.

WEN C M, LEE C W, WANG C S, et al, 2008. Development of two cell lines frombrain tissue for characterization of betanodavirus and megalocytivirus infectivity and propagation[J]. Aquaculture, 278(1–4): 14–21.

XUE T, WANG Y Z, PAN Q H, et al, 2018. Establishment of a cell line from the kidney of black carp and its susceptibility to spring viremia of carp virus[J]. Journal of Fish Diseases, 41(2): 365–374.

ZHANG B, WANG X L, SHA Z X, et al, 2011. Establishment and characterization of a testicular cell line from the half-smooth tongue sole,[J]. International Journal of Biological Sciences, 7(4): 452–459.

ZHU D M, YANG K, WANG W M, et al, 2013. Establishment and characterization of a fin cell line from blunt snout bream,[J]. Fish Physiology and Biochemistry, 39(6): 1399–1410.

Establishment and characterization of gill cell line from the spotted scat

ZHOU Jianan1, SU Maoliang2, 3, ZHANG Junbin1, 2

1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;2. Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresource & Eco-Environmental Science, College of Life Sciences and Oceanography,Shenzhen University, Shenzhen 518060, China;3. Key Laboratory of Optoelectronic Devices and Systems of Ministry of Education and Guangdong Province, College of Optoelectronic Engineering, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China

Gill is the main osmoregulatory organ in fish, and the establishment of gill cell can provide an important experimental platform to reveal the osmoregulatory mechanism. As a euryhaline fish,is an ideal animal model for such studies. This study aimed to establish the branchial cell line of.. The conditions for primary culture and subculture were optimized, and cell characteristics were analyzed. The optimum growth performance was observed in the branchial cell line of.at 28℃ in L-15 that contained 20% fetal bovine serum (FBS), and could be successfully subcultured in 2-4 days. The population doubling time (PDT) of SG (abbreviation for the branchial cell line established in present study) cell line was 40.8 h. Eighty-seven percent SG cells could be resuscitated after cryopreservation in liquid nitrogen. To adapt to the water environment, branchial cells could maintain homeostasis through the osmotic stress response mechanism. SG cells were grown in culture media at different osmotic pressures, and cell proliferation and morphological changes were observed in this study. SG cells could proliferate during hypotonic and hyperosmotic stress (150 and 600 mOsmol·kg–1), and the proliferation rate under hypotonic stress was 1.5 times higher than that under hyperosmotic stress. It was observed that the volume of SG cell expanded in the hypotonic medium and shrank in the hyperosmotic condition. Our results indicated that SG cells have strong osmotic tolerance, with a high adaptation in the hypoosmotic environment. The establishment of SG cell line provides basic experimental materials for the study of osmotic pressure response mechanism.

; gill cell line; primary culture; subculture

10.11978/2019017

http://www.jto.ac.cn

Q965.3

A

1009-5470(2019)06-0090-08

2019-02-18;

2019-04-03。

林強(qiáng)編輯

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41806177); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41741006)

周佳楠(1995—), 女, 新疆維吾爾自治區(qū)昌吉市人, 碩士, 從事海洋生物學(xué)研究。E-mail: jiananzhou0608@163.com

張俊彬, 教授。E-mail: jbzhang@szu.edu.cn

2019-02-18;

2019-04-03.

Editor: LIN Qiang

National Natural Science Fund(41806177); National Natural Science Fund(41741006);

ZHANG Junbin. E-mail: jbzhang@szu.edu.cn