溶菌酶的修飾、功能特性及其在食品保鮮中的應(yīng)用研究進(jìn)展

孫 浩，石玉剛,*，朱陳敏，張潤(rùn)潤(rùn)，陳建設(shè)，Rammile ETTELAIE

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.利茲大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)院，英國(guó) 利茲 LS29JT）

溶菌酶（lysozyme，LZ），又稱N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrase），是一種能特異性水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的糖苷水解酶。不同來(lái)源的LZ，其作用底物的種類及位點(diǎn)均有差異。蛋清LZ因來(lái)源廣泛、成本低廉等特點(diǎn)，應(yīng)用范圍廣闊。蛋清LZ是由129 個(gè)氨基酸組成的一條單一肽鏈，含4 對(duì)二硫鍵交聯(lián)結(jié)合，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在較大pH值范圍內(nèi)活性不受影響[1-2]。它的活性中心（Glu-35和Asp-52）可催化水解N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺間的β-1,4糖苷鍵。Glu-35作為質(zhì)子供體，攻擊底物C—O—C糖苷鍵的氧，而Asp-52共同參與穩(wěn)定產(chǎn)生的瞬時(shí)C—O正離子再與離子化水分子生成的—OH發(fā)生反應(yīng)[3-4]。通過(guò)N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶活性，破壞肽聚糖，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂、內(nèi)容物泄露而使細(xì)菌溶解，從而實(shí)現(xiàn)殺菌。LZ的主要作用對(duì)象是革蘭氏陽(yáng)性菌（G＋）的細(xì)胞壁。

作為大多數(shù)哺乳動(dòng)物的先天免疫防御因子，LZ可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬和消化功能，與細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）結(jié)合，減少內(nèi)毒素的釋放，提高機(jī)體抵抗力。歐盟食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)（E1105）已將其視作具有抑菌、溶菌和殺菌活性的功能因子，且美國(guó)藥物管理局將其列為常規(guī)安全組分[5]。我國(guó)已允許將LZ用作嬰兒奶粉的添加劑，以提高嬰兒腸道抗感染能力，促進(jìn)嬰兒腸道中雙歧桿菌的增殖。此外，基于LZ的保鮮劑對(duì)水產(chǎn)品具有良好的防腐效果[6]。但由于革蘭氏陰性菌（G－）的細(xì)胞壁外存在LPS層，對(duì)自然溶菌酶（natureal lysozyme，NLZ）具有抗性，故NLZ對(duì)G－幾乎無(wú)抑菌作用。為了拓寬LZ在食品抑菌方面的應(yīng)用范圍，近20 年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者們不斷嘗試對(duì)LZ進(jìn)行各類修飾與改性，使LZ可以透過(guò)G－的LPS或與其相互作用，進(jìn)入細(xì)胞，繼而裂解細(xì)胞，擴(kuò)展LZ的抗菌譜。目前LZ的分離純化及傳統(tǒng)修飾等方面綜述已有一定的報(bào)道[2,7-10]。本文結(jié)合本課題組的前期工作，參考國(guó)內(nèi)外有關(guān)的最新研究報(bào)道，重點(diǎn)就目前LZ的增效技術(shù)進(jìn)行了詳細(xì)綜述，特別是結(jié)合了納米及材料技術(shù)后的發(fā)展動(dòng)態(tài)，著重關(guān)注了改性LZ在食品貯藏與保鮮等領(lǐng)域中的應(yīng)用，以期為L(zhǎng)Z的深度開(kāi)發(fā)和綜合利用提供可靠理論依據(jù)。

1 化學(xué)修飾

對(duì)LZ分子的化學(xué)修飾，是通過(guò)利用小分子或大分子化合物對(duì)LZ的側(cè)鏈氨基酸基團(tuán)進(jìn)行處理，以獲得具有特殊功能特性的蛋白質(zhì)分子。目前用于LZ分子的表面化學(xué)修飾的化合物主要為有機(jī)小分子、多糖及其他分子。其中主要有機(jī)小分子包括脂肪酸、酚酸（醛）等；多糖包括半乳甘露聚糖、葡聚糖、甘露聚糖、殼聚糖等。

1.1 小分子修飾

利用有機(jī)小分子對(duì)LZ進(jìn)行親脂化修飾是LZ增效的重要手段之一（表1）。疏水性有機(jī)小分子與LZ的賴氨酸殘基（氨基）共價(jià)結(jié)合后，起到疏水性載體的功能，將LZ送至質(zhì)膜層。Ibrahim等[11]早在1990年就著手開(kāi)展LZ的親脂化修飾研究。將棕櫚酸與蛋清LZ結(jié)合，發(fā)現(xiàn)酶活力基本不變，而修飾后LZ對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）和遲緩愛(ài)德華氏菌（Edwardsiealla tarda，E. tarda）等G－表現(xiàn)出一定的抑菌活性，但過(guò)量結(jié)合棕櫚酸分子將導(dǎo)致LZ抗菌活性喪失[11]。改用中短鏈飽和脂肪酸替代，可有效解決上述因棕櫚酸的過(guò)量結(jié)合而導(dǎo)致的抗菌活性損失問(wèn)題。隨短鏈脂肪酸結(jié)合數(shù)量的增加，抗菌活性增強(qiáng)，但酶活力損失也隨之增大。于是，在親脂化修飾前，先利用美拉德反應(yīng)對(duì)LZ實(shí)施糖基化修飾，既可避免酶活力損失（酶活力回收率從47.4%提升至82.4%），產(chǎn)物又對(duì)E. coli表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗菌活性[12]。Takahashi等[13]亦將葡萄糖硬脂酸單酯與LZ通過(guò)Maillard反應(yīng)共價(jià)交聯(lián)，交聯(lián)物的等電點(diǎn)降低至6～7，增加了LZ在酸性環(huán)境中的溶解度，并使其變性溫度提升至74 ℃，但對(duì)E. coli并無(wú)抑菌效果，對(duì)G＋菌抑制活性只保留了70%。

自身具有抑菌活性的酚酸（醛）類有機(jī)小分子也常被用于LZ的共價(jià)修飾。LZ中約0.5～4 個(gè)氨基可與紫蘇醛偶聯(lián)，保留了LZ的酶活力（＞70%），且交聯(lián)物使E. coli和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）的存活率分別從80%與40%降至20%和10%[14]。肉桂醛與LZ（物質(zhì)的量比為1∶3）偶聯(lián)后產(chǎn)物（LC-3）的抑菌效果最佳，對(duì)E. coli和S. aureus的抑菌性能較NLZ分別提高了35.29%和72.73%，經(jīng)LC-3（125 μg/g）處理28 d后，菌落總數(shù)降低至7.4×108CFU/g[15]。阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）修飾LZ的偶聯(lián)產(chǎn)物（FA-LZ）的酶活力略有下降，但對(duì)G－的抑菌作用增強(qiáng)，修飾酶對(duì)E. coli和腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis，S. enteritidis）的最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）均為0.5 mg/mL，對(duì)S. aureus的抑菌作用略有下降[16]。本課題組前期研究了經(jīng)酚酸系列物（咖啡酸、阿魏酸、芥子酸等）修飾后LZ的抑菌特性變化，并總結(jié)出了抑菌特性與修飾物分子結(jié)構(gòu)間的相互關(guān)系。此外，還可通過(guò)含氨基的活性分子與LZ的羧基共價(jià)結(jié)合。如Ramezani等[17]將LZ與氨基葡萄糖和碳化二亞胺分別按1∶1∶1質(zhì)量比混合反應(yīng)。交聯(lián)物熱穩(wěn)定性提高了140%，高pH值環(huán)境下溶解度依然保持在82%以上，乳化穩(wěn)定性等也有所改善。

1.2 多糖修飾

天然多糖及其衍生物在食品工業(yè)中既可作為凝膠、增稠劑、乳化劑和穩(wěn)定劑，又可作為鍍膜和涂層物質(zhì)減緩食品的變質(zhì)。在一定條件下，多糖分子還原末端的醛基可與蛋白質(zhì)分子中氨基酸側(cè)鏈的自由氨基（主要是賴氨酸側(cè)鏈上的ε-NH2）發(fā)生Maillard反應(yīng)，生成蛋白質(zhì)-多糖共價(jià)復(fù)合物，能夠增強(qiáng)蛋白質(zhì)的功能特性，如溶解性、凝膠性、乳化性、起泡性等。其中，LZ的Lys-1末端氨基和Lys-98的ε-NH2基團(tuán)是其與多糖交聯(lián)的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)[18]。

Ibrahim等[11]在多糖與LZ間的Maillard反應(yīng)與交聯(lián)產(chǎn)物性能評(píng)價(jià)等方面做了較多貢獻(xiàn)（表1）。LZ與半乳甘露聚糖的Maillard反應(yīng)產(chǎn)物（圖1）（質(zhì)量比1∶1、pH 9.5、60 ℃、相對(duì)濕度79%），在50 ℃、40 min內(nèi)可將E. coliIF0 12713全部殺滅；且50 mg/mL交聯(lián)物可在60 min內(nèi)可將E. tarda的存活率降低80%[19]。LZ與葡聚糖交聯(lián)產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性、溶解度和乳化性得到了極大的提高[20]。

此外，在50 mmol/L亞硫酸鈉或半胱氨酸的存在下，利用葡聚糖、甘露聚糖、半乳甘露聚糖與LZ反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)LZ與多糖以1∶5的物質(zhì)的量比在60 ℃、pH 8.5時(shí)反應(yīng)7 d后，達(dá)到最佳糖基化程度[21]。Hashemi等[22]研究發(fā)現(xiàn)LZ與黃原膠（xanthan gum，XG）（質(zhì)量比1∶1、pH 8.5、60 ℃、相對(duì)濕度79%）通過(guò)Maillard反應(yīng)得到交聯(lián)物XG-LZ（400 μg/mL）可將E. coli與S. aureus的菌落總數(shù)分別減少3（lg（CFU/mL））和2（lg（CFU/mL））。黃芪膠由脂溶性成分黃蓍膠糖和水溶性成分黃蓍質(zhì)（tragacanthin，TRG）物理混合構(gòu)成。最適反應(yīng)條件下（質(zhì)量比5∶1、pH 8.5、60 ℃、相對(duì)濕度79%，8 d），大約2 mol TRG與1 mol LZ發(fā)生交聯(lián)。TRG-LZ（4 000 μg/mL）交聯(lián)物的抑菌效果顯著提高，對(duì)S. aureus E. coli、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，B. cereus）和傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi，S. typhi）的抑制率分別為90%、50%、80%和40%，但酶活力降低了約20%，這或許是由于多糖附著在蛋白質(zhì)表面的自由賴氨酸產(chǎn)生了空間位阻而阻礙了酶底物復(fù)合體的形成[23]，這與Nakamura[19]、Johnson[24]、Yadav[25]等的報(bào)道一致。TRG-LZ交聯(lián)物的溶解性隨著交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，且隨pH值的增大而減小；乳化活性（較NLZ提高了84%）與泡沫活性均被提高，但乳化穩(wěn)定性在反應(yīng)2 d后緩慢下降。阿拉伯膠（acacia gum，AG）與LZ的交聯(lián)物在酸性條件下具有更好的溶解性、熱穩(wěn)定性、乳化性和發(fā)泡性。此外，AG-LZ能顯著地抑制體外和蛋黃醬中的S. aureus和E. coli的生長(zhǎng)，將殺菌時(shí)間從10 d縮短為3～5 d[26]。Alahdad等[27]發(fā)現(xiàn)硫酸葡聚糖與LZ交聯(lián)后對(duì)溶壁微球菌的溶解活性降低了31%，位阻增大和正電荷減少可能是交聯(lián)后酶裂解活性下降的主要原因。

圖 1 多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合方式的美拉德反應(yīng)示意圖[21,28]Fig. 1 LZ-polysaccharide conjugate was prepared via a Maillard-type reaction[21,28]

表 1 有機(jī)小分子及多糖修飾LZ及其功能改善情況Table 1 Improved properties of modified LZ with small organic molecules or polysaccharides

1.3 其他改性方法

Nodake等[35]用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）化學(xué)修飾LZ，提高了LZ在堿性環(huán)境中的溶解性和對(duì)蛋白酶的水解抗性，修飾后的LZ能更好地與G－的LPS結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞外膜破損。Freitas等[36]又利用PEG的衍生物（聚乙二醇單甲醚-p-硝基苯基碳酸鹽）對(duì)LZ進(jìn)行修飾，修飾物在pH 6～10范圍內(nèi)仍保留完整的酶活性，且在50 ℃下仍有活性。這類修飾方法可使LZ適用于溫度和pH值變化較大的食品加工過(guò)程中。Touch等[37]利用半胱氨酸的巰基與LZ的二硫鍵交換，由此引入新的巰基，使LZ結(jié)構(gòu)更加靈活，表面疏水性增加，與S. enteritidis的LPS層連接更緊密，穿透細(xì)菌外膜能力增強(qiáng)，具有比LZ或僅熱處理溶菌酶（heated lysozyme， HLZ）更顯著的抗菌活性，對(duì)S. enteritidis的MIC比LZ和HLZ分別下降99.3%和96%，效果堪比一些抗生素。

2 物理改性

化學(xué)修飾法自身存在的缺點(diǎn)限制了其在食品中的應(yīng)用范圍，如化學(xué)試劑的毒性、修飾物引入而導(dǎo)致的食品感官變化等；而物理改性是通過(guò)熱、壓力、機(jī)械能等手段改變蛋白質(zhì)分子構(gòu)象和聚集，從而強(qiáng)化LZ的抑菌活性，更適于在食品體系中應(yīng)用。

2.1 熱處理

升高溫度有利于氨基酸的疏水性位點(diǎn)暴露，從而增加熱處理衍生物（heat-denatured lysozyme derivative，HDLZ）低聚體的表面疏水性，以及微生物（如E. coliK-12）細(xì)胞膜的結(jié)合能力，尤其與細(xì)胞內(nèi)膜，致使細(xì)胞膜破損而使細(xì)胞死亡。Ibrahim等[28]發(fā)現(xiàn)LZ的熱處理（pH 7.2、80 ℃、20 min）衍生物HDLZ仍保留54%的活性。盡管HDLZ活性隨處理溫度升高而降低，而對(duì)E. coli的抑制活性卻增強(qiáng)。上述熱處理后LZ中三段肽（T8、T9、T13）消失，出現(xiàn)4 個(gè)全新的尖峰。說(shuō)明通過(guò)環(huán)狀亞胺的形成，三段肽轉(zhuǎn)為β構(gòu)象。由此證實(shí)，加熱引起了LZ的構(gòu)象變化[10,38]。Derde等[39]通過(guò)測(cè)定最大斜率和滯后時(shí)間，對(duì)比了LZ與干熱處理溶菌酶（dry heat treatment lysozyme，DHLZ）對(duì)E.coliML-35p細(xì)胞內(nèi)外膜通透性的影響，也證實(shí)了DHLZ的親膜活性更高，致使其對(duì)E. coli的殺菌效果更強(qiáng)。該課題組也探討了DHLZ對(duì)G－的作用機(jī)制，結(jié)合表面壓力和原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）成像技術(shù)分析了LZ與磷脂間的相互作用[40]，發(fā)現(xiàn)DHLZ（80 ℃、7 d）的物理化學(xué)性質(zhì)（正電荷與柔變性）變化促進(jìn)了其插入細(xì)胞膜的程度，進(jìn)而誘導(dǎo)脂質(zhì)重組和增大膜破壞度，最終強(qiáng)化了其殺菌性能。此外，DHLZ疏水性高、表面活性強(qiáng)，且所帶正電荷增多，更易與外膜結(jié)合作用而使細(xì)胞膜產(chǎn)生更多更大的孔穴；與內(nèi)膜作用而形成更多離子通道，這都增加了其對(duì)細(xì)胞膜的吸附與穿透能力[41]。

Cegielska-Radziejewska等[42]利用化學(xué)改性和熱化學(xué)改性的方式制備了4 種LZ改性物。這些修飾方法均減小了LZ的水解活性，但對(duì)熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens，P. fluorescens）的抑制活性均有所提高。其中，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)1%雙氧水改性的LZ在6 h內(nèi)可降低GP. fluorescens3.3（lg（CFU/mL）），4 種改性物對(duì)G＋表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，S. epidermidis）均表現(xiàn)出很強(qiáng)的殺菌效果，6 h后菌落總數(shù)小于1.5（lg（CFU/mL）。將體積分?jǐn)?shù)1%雙氧水改性的LZ應(yīng)用于豬肉糜的貯藏保鮮，豬肉糜中添加入CT2（5 mg/150 g），4 ℃貯藏144 h后，發(fā)現(xiàn)對(duì)假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）、腸桿菌（Enterobacteriaceae）和乳酸菌均具有較好抑制作用，這是因?yàn)闊崽幚恚╬H 4、70 ℃、15 min）顯著提高了酶分子的疏水性[43]。

2.2 高壓處理

高壓技術(shù)是一種非熱食品加工技術(shù)，在常溫或較低溫下采用100～900 MPa壓力下進(jìn)行[44]。經(jīng)高壓處理后，不僅破壞了蛋白質(zhì)分子間的氫鍵、離子鍵等非共價(jià)鍵，還引起了理化性質(zhì)的改變。Vannini等[45]研究了高壓均質(zhì)（high pressure homogenization，HPH）對(duì)脫脂牛奶中的LZ的抑菌活性的影響。HPH（100～130 MPa、37 ℃）處理3 h可明顯減少脫脂奶中單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，L. monocytogenes）、E. coli和S. enteritidis的活菌數(shù)。HPH與LZ之間的相互作用關(guān)聯(lián)著蛋白的構(gòu)象改變。LZ經(jīng)HPH處理后，對(duì)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，L. plantarum）具有抑制作用，但LZ無(wú)此效果，進(jìn)一步證明HPH促使LZ活性中心結(jié)構(gòu)改變。研究人員還通過(guò)將HPH（100 MPa）與短時(shí)熱處理結(jié)合，成功強(qiáng)化了LZ對(duì)牛乳中L. monocytogenes的抑菌效能，掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）結(jié)果顯示，HPH-LZ使L. monocytogenes細(xì)胞膜大面積破損，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物泄漏[46]。Tribst等[47]對(duì)比研究了HPH（＜190 MPa）和高壓處理（high pressure process，HPP）（＜600 MPa）對(duì)LZ酶活力及抑菌活性的影響。兩種高壓條件下酶活力均提高（HPH提高29%、HPP提高17%），但僅HPP能提高LZ對(duì)B. cereus和嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus，G. stearothermophilus）的抑菌活性，分別提高50%和66%，而對(duì)E. coli和糞腸球菌（Enterococcus faecalis，E. faecalis）的抑制效果不明顯。高壓處理對(duì)LZ的抑菌活性的調(diào)節(jié)機(jī)制可能是：1）對(duì)細(xì)胞壁或外膜的直接破壞作用；2）隨后胞內(nèi)酶透過(guò)破損細(xì)胞膜的泄漏量增加；3）高壓技術(shù)使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，充分暴露了疏水區(qū)，使蛋白不易發(fā)生凝聚，與細(xì)胞膜結(jié)合作用增強(qiáng)。

3 生物改性

生物改性也是一種提升LZ抑菌性能的方法，將疏水肽或抗菌肽直接引入LZ分子結(jié)構(gòu)中，增強(qiáng)其對(duì)G－的抑菌活性。如Kato等[48]將定點(diǎn)突變后的LZ編碼序列導(dǎo)入酵母細(xì)胞中，使平均分子質(zhì)量為75 kDa的聚甘露醇-LZ衍生物（R2lT）在酵母表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生。為了提高對(duì)E. coli的抑菌活性，利用DNA重組技術(shù)將疏水肽（Phe-Val-Pro（H3）Phe-Phe-Val-Ala-Pro（H5）、Phe-Phe-Val-Ala-Ile-Ile-Pro（H7））基因序列插入至LZ cDNA的Leu 129 C-末端。改性后LZ保持了75%～80%的酶活性，但對(duì)E. coli的抑菌活性增強(qiáng)，并進(jìn)一步指出疏水肽鏈長(zhǎng)度與催化區(qū)對(duì)疏水肽融合LZ的抗菌活性起重要作用[49]，這是其對(duì)E. coli細(xì)胞內(nèi)膜的電化學(xué)勢(shì)能的破壞與LZ對(duì)外膜和肽聚糖共同作用的結(jié)果[50]（圖2）。此外，Zhu Dewei等[51]利用可抑制G－菌生長(zhǎng)的抗菌肽（shorter peptide，SP）（A-W-V-A-W-K）對(duì)野豬溶菌酶（Sus scrofalysozyme，SSL）的C-末端和N-末端進(jìn)行融合，制備了5 種重組結(jié)構(gòu)（圖3）。發(fā)現(xiàn)N-末端融合重組體（SP-SSL和6SP-SSL）對(duì)G－表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗菌性能，特別是6SP-SSL，并指出增加N-末端融合SP的重復(fù)單元，有利于提高其抑菌效果，這是因?yàn)楦纳屏嗣傅氖杷?，更有利于疏水性?xì)胞膜相互作用。未來(lái)將更多關(guān)注肽鏈-LZ融合物的晶體結(jié)構(gòu)分析，這有利于探究其抑菌作用機(jī)制，尋找到LZ抑菌活性的理性調(diào)控策略。

圖 2 LZ蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中加入一個(gè)外露的疏水結(jié)構(gòu)域[49-50]Fig. 2 Interaction between cell membrane and hydrophobic peptidefused LZ[49-50]

圖 3 抗菌肽修飾LZ產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)[51]Fig. 3 Schematic illustration of five recombinant constructs for modified LZ with antibacterial peptides[51]

4 含LZ的新型抗菌材料

近年來(lái)，納米與材料技術(shù)的蓬勃發(fā)展為新型抗菌材料的制備與應(yīng)用提供了一條廣闊途徑。目前的研究主要集中在開(kāi)發(fā)一類制備方法簡(jiǎn)單、無(wú)毒、多功能復(fù)合、易回收的高效抗菌新材料，如抗菌膜，可作為功能因子的載體，通過(guò)活性成分的可控釋放，實(shí)現(xiàn)抗氧或抑菌的長(zhǎng)效表現(xiàn)。

4.1 靜電紡絲納米纖維抗菌膜

靜電紡絲是一種簡(jiǎn)單高效的納米纖維制備方法。產(chǎn)品自身的細(xì)孔結(jié)構(gòu)和高比表面積更有利于抗菌成分從包裝材料向食品表面持續(xù)釋放[52]。Zhang Tingting等[53]運(yùn)用層層自組裝技術(shù)（lay-by-lay self-assembly technique，LBL）將帶正電荷的LZ與帶負(fù)電荷的果膠層層交替地附著于纖維素納米纖維墊上（圖4）。隨著外層包覆膜厚度的增加，纖維素墊的抑菌活性提高。其中，（LZ/果膠）10.5LBL多層（LZ占據(jù)外表面）包覆納米纖維素墊具有最強(qiáng)的抑菌活性，對(duì)E. coli和S. aureus的抑菌圈直徑分別為6.7 mm和8.6 mm；這是因?yàn)閹д姾蒐Z易于吸附在帶負(fù)電的細(xì)胞表面，有利于進(jìn)攻肽聚糖；其次，果膠通過(guò)增加黏度提高對(duì)G＋的抑菌活性。Feng Kun等[54]將LZ與肉桂精油（cinnamon essential oil，CEO）作為抑菌劑，結(jié)合聚乙烯醇（cinnamon essential oil，PVA）與環(huán)糊精（β-cyclodextrin，β-CD）制備出新型靜電紡絲納米抗菌膜（PVA/β-CD/CEO/LZ）；當(dāng)上述兩種抑菌劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.25%和2%時(shí)，抗菌膜對(duì)L. monocytogenes和S. enteritidis表現(xiàn)出最強(qiáng)抑菌活性，MIC為0.8～1 mg/mL，最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）為6～7 mg/mL。對(duì)Aspergillus niger和Penicillium也表現(xiàn)出卓越的抗真菌效果。因此，該靜電紡絲納米抗菌膜可被用于食品的貯運(yùn)與包裝。

圖 4 納米纖維墊上的LZ/果膠層層自組裝過(guò)程[53]Fig. 4 Schematic diagram of LZ/pectin LBL modification through layer-by-layer self-assembly on nanofibrous mats[53]

4.2 可食用抗菌膜

活性抗菌膜在防治食源性致病微生物引起的食品污染中的優(yōu)勢(shì)作用亦引起學(xué)者們的極大興趣，學(xué)者們尤其熱衷于制備無(wú)毒、可生物降解、原材料天然且成本低廉、可食用的抗菌膜[52,55-58]。Khairuddin等[56]通過(guò)溶液澆鑄技術(shù)制備了LZ/小麥淀粉膜。48 h后，可將E. coli和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，B. subtilis）的數(shù)量分別減小至1.74（lg （CFU/mL））和3.48（lg （CFU/mL））。Silva等[57]運(yùn)用水懸液溶劑澆鑄技術(shù)制備了由支鏈淀粉（pullulan，PL）和LZ納米纖維（lysozyme nanofibers，LNFs）構(gòu)成的透明、光滑的可食用保鮮納米復(fù)合膜（PL/LNFs），其具有較好的機(jī)械性能（1.91～2.50 GPa）和熱穩(wěn)定性（＞225 ℃）。LNFs的引入強(qiáng)化了膜的抗氧化及抑菌活性，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）的消除活性為77%（LNFs質(zhì)量分?jǐn)?shù)15.0%），對(duì)S. aureus的抑菌效果隨著LNFs的含量增加而增強(qiáng)。Zimoch-Korzycka等[52]利用羥丙基甲基纖維素（hydroxypropyl methyl cellulose，HPMC）水溶液和殼聚糖（chitosan，CS）作為鑄膜材料，將血清胱抑素（cystatin，C）/LZ（C/LZ）用作抗菌劑，制備出一種可食用抗菌膜（HPMC/CS/C/LZ）；發(fā)現(xiàn)提高CS與C/LZ含量可增加抗菌膜對(duì)黃色微球菌（Micrococcus flavus，M. flavus）和無(wú)名假絲酵母（Candida famata，C. famata）的抑制活性；因制備過(guò)程簡(jiǎn)易，且熱機(jī)械性和抑菌活性良好，其有望被廣泛應(yīng)用于肉制品的包裝與貯藏過(guò)程。Wang Zhe等[55]利用膠原蛋白與LZ制備4 種組成不同的可食用膜（CL1～4），并將其用于三文魚(yú)切片的保鮮。結(jié)果表明4 種可食用膜能明顯提升三文魚(yú)切片在4 ℃保藏15 d后的產(chǎn)品品質(zhì)；尤其是CL4（0.007 g/mL LZ、0.04 g/mL膠原蛋白）可明顯減少總揮發(fā)性鹽基氮含量，又能顯著抑制三文魚(yú)冷藏中微生物的生長(zhǎng)。Benelhadj等[58]利用鈍頂螺旋藻分離蛋白（arthrospira platensis，API）與LZ復(fù)合制備了一種用于食品貯藏的可食用LZ/API抗菌膜。膜中LZ的釋放動(dòng)力學(xué)特性受pH值影響，其中pH 7時(shí)LZ的釋放率較低，這是由此時(shí)帶正電LZ與帶負(fù)電API間的強(qiáng)相互靜電吸引作用所致，進(jìn)一步影響可食用膜的抑菌效能。

4.3 雜化抗菌膜

有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化膜是在有機(jī)網(wǎng)絡(luò)中引入無(wú)機(jī)質(zhì)點(diǎn)，改善了網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和修飾膜的孔結(jié)構(gòu)和分布，提高了膜的綜合性能。如Sun Junfen等[59]采用原位合成法制備CS/羥基磷灰石（hydroxyapatite，HAP）雜化膜（CS/HAP），用于吸附LZ。在pH 10.0、LZ平衡質(zhì)量濃度1.96 mg/mL時(shí)，CS/HAP雜化膜最大吸附量可達(dá)203.9 mg/g。Yu Wuzhong等[60]先將CS/Ag/HAP雜化膜通過(guò)電化學(xué)聚集技術(shù)固定在表面，再將LZ膜附著其上，以此提高雜化膜（LZ/CS/Ag/HAP）的抗菌性能。12 h后雜化膜對(duì)E. coli和S. aureus的抑制效率分別為95.28%和98.02%，且持續(xù)5 d后的抑菌效能仍為95.42%和97.46%。Li Xiang等[61]將LZ/累托石（rectorite，REC）復(fù)合物與CS溶液混合，制成具有抑菌活性的雜化薄膜（CS/REC/LZ）。雜化膜對(duì)E. coli和S. aureus的生長(zhǎng)抑制率分別為45.12%和92.67%。這是由于REC有利于吸附和固定細(xì)菌；其次，CS單鏈的聚集增加了單位體積的正電荷，對(duì)G－的抗菌活性更強(qiáng)（E. coli表面的負(fù)電荷密度大于S. aureus，更容易被帶正電的雜化膜吸附殺滅）。近年來(lái)，基于碳納米管的膜材料方面研究不斷的深入。將LZ與埃洛石納米管（halloysite nanotubes，HNTs）結(jié)合后制得LZ/HNTs納米復(fù)合物，經(jīng)高能球磨法將該復(fù)合物與聚乳酸（polylactic acid，PLA）制成厚度為150 μm的抗菌膜（PLA/HNTs/LZ）?；?qū)NTs-LZ納米復(fù)合物與聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）組合，通過(guò)熱壓鑄膜技術(shù)制備出抗菌膜（PCL/HNTs/LZ）。這些膜均對(duì)Bacillussp.有抑制作用[5]。

4.4 其他納米復(fù)合材料

通過(guò)吸附、包覆和表面交聯(lián)等技術(shù)將LZ固定在納米材料上，調(diào)整改變納米包裝材料的形態(tài)，有效調(diào)節(jié)了LZ的釋放速率。

自組裝超薄膜的結(jié)構(gòu)及制備工藝相對(duì)簡(jiǎn)單。構(gòu)建大尺寸的自組裝結(jié)構(gòu)需要借助于模板，在模板和組件層之間的靜電相互作用是層層修飾過(guò)程的驅(qū)動(dòng)力。通過(guò)LBL自組裝技術(shù)，可將LZ和單寧酸（tannic acid，TA）交替地沉積在Fe3O4納米粒子表面[62]。通過(guò)聚電解質(zhì)多層膜擴(kuò)散可將Ag＋與TA酚羥基結(jié)合作用，原位還原制得新型納米銀磁性復(fù)合材料(LZ/TA)n-Ag（圖5）。TA中豐富的羰基和酚官能團(tuán)能與LZ分子間形成良好的氫鍵，從而提高薄膜的穩(wěn)定性。同時(shí)，(LZ/TA)5-Ag磁性顆粒表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗菌活性，其中納米銀磁性納米復(fù)合材料（magnetic nanocomposite arming with silver nanoparticles，AgNPs）濃度從1.5 mmol/L增加到3.5 mmol/L，E. coli和S. aureus的抑菌圈直徑增大3～4 mm，表明膜的抗菌性能主要取決于納米Ag含量。并進(jìn)一步解釋了(LZ/TA)n5-Ag對(duì)E. coli的作用機(jī)制，即(LZ/TA)n5-Ag可改變細(xì)胞膜的通透性，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞釋放胞質(zhì)β-半乳糖苷酶增多。雷文茜等[63]以聚丙烯酸（polyacrylic acid，PAA）和聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）為構(gòu)筑單元，運(yùn)用LBL自組裝技術(shù)制備了一種“動(dòng)態(tài)”聚電解質(zhì)多層膜(PEI/PAA)n。該復(fù)合膜獨(dú)特的海綿結(jié)構(gòu)在飽和水蒸氣的處理下可閉合回歸成致密膜結(jié)構(gòu)，借助簡(jiǎn)單的毛細(xì)作用將LZ負(fù)載并固定于多層膜中。此抗菌膜可有效抑制S.aureus，且同時(shí)負(fù)載LZ和乳鐵蛋白的多層膜還可提升對(duì)E.coli的殺菌效果。

蛋白質(zhì)通過(guò)共價(jià)交聯(lián)結(jié)合在納米材料表面，同時(shí)保持其自身的結(jié)構(gòu)、功能和穩(wěn)定性，是生物納米材料制備技術(shù)中的一個(gè)重要過(guò)程，也是蛋白質(zhì)固定化領(lǐng)域的重要應(yīng)用。如Borzooeian等[64]通過(guò)碳化二亞胺交聯(lián)劑將LZ固定在具有羰基功能團(tuán)的單壁碳納米管（single walled carbon nanotubes，SWCNTs）上，在70 ℃，pH 3.0～10.0范圍內(nèi)表現(xiàn)出卓越的穩(wěn)定性。Liburdi等[65]使用戊二醛交聯(lián)劑將LZ共價(jià)結(jié)合在可食用CS珠上，并研究了交聯(lián)物在真實(shí)白酒體系中的抑菌活性。結(jié)果表明，盡管共價(jià)修飾酶在白酒中的抑菌活力較NLZ有所下降，但酶活力穩(wěn)定性提高，且抑菌活性并未受到白酒中自由SO2及總酚濃度的影響。楊龍平等[66]為了提高LZ的穩(wěn)定性及對(duì)G－的抑菌性能，以Au納米顆粒為核，通過(guò)表面定向修飾LZ，制備了LZ-Au納米抑菌顆粒。并發(fā)現(xiàn)與未修飾的納米Au及NLZ相比，LZ-Au納米顆粒對(duì)S. aureus和E. coli的抑菌效果均顯著增強(qiáng)，且有協(xié)同抑菌作用；LZ-Au納米顆粒（0.1 g/L）可以徹底殺死兩種細(xì)菌，并且具有持久抑菌性及良好的生物相容性。

深度共熔溶劑（deep eutectic solvents，DES）由于其自身獨(dú)特物化性質(zhì)被人們視為可能比離子液體更為綠色的非水介質(zhì)而被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。最近，Silva等[67]報(bào)道了一種基于DES的LZ納米纖維的高效制備方法。LZ（約70 000 U/mg）溶解于含有20 mmol/L甘氨酸的HCl緩沖溶液（pH 2、10 mmol/L）中，與體積分?jǐn)?shù)10%深度共熔溶劑（氯化膽堿、乙酸體積比1∶1）混合均勻，50 ℃和70 ℃培養(yǎng)。最終獲得了長(zhǎng)0.5～1 μm、厚0.02～0.1 μm的LNFs。

圖 5 層層自組裝制備(LZ/TA)n- Ag的過(guò)程及其抑菌性能分析[62]Fig. 5 Schematic illustration of the fabrication process of (LZ/TA)n-Ag nanoparticles through layer-by-layer self-assembly and assessment of their antibacterial properties[62]

5 結(jié) 語(yǔ)

LZ因其獨(dú)特的生物學(xué)功能，在食品等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的開(kāi)發(fā)前景。通過(guò)化學(xué)、物理和生物改性方法，以及結(jié)合納米與材料技術(shù)或新型綠色溶劑技術(shù)等對(duì)LZ實(shí)施分子結(jié)構(gòu)修飾，突破其自身的局限性，提高其對(duì)G－的抑菌效能，擴(kuò)大抑菌譜，有著重大的科學(xué)和現(xiàn)實(shí)意義。主要改性方法有：1）引入修飾分子，提高LZ的疏水性（親脂性），或是與修飾物自身的抑菌效果協(xié)同增效；2）借助機(jī)械能或環(huán)境條件變化（溫度、壓力、pH值、介質(zhì)極性等），調(diào)整LZ分子構(gòu)象或聚集狀態(tài)，暴露更多的氨基酸疏水性活性位點(diǎn)；3）提高修飾后LZ自身正電荷分布；4）借助納米與材料技術(shù)，提高LZ的抑菌作用效率與時(shí)長(zhǎng)，拓展基于LZ的新型納米材料在食品中的應(yīng)用范圍。未來(lái)研究人員仍會(huì)持續(xù)關(guān)注納米制備新技術(shù)與納米新材料在LZ增效應(yīng)用中的可行性，并將修飾LZ安全有效地應(yīng)用于食品領(lǐng)域。同時(shí)，對(duì)LZ分子進(jìn)行更理性地構(gòu)效調(diào)節(jié)也將是一個(gè)重要領(lǐng)域，深入結(jié)合化學(xué)或基因重組技術(shù)對(duì)LZ進(jìn)行定點(diǎn)改造。這些研究能為L(zhǎng)Z研究開(kāi)發(fā)和綜合利用提供理論依據(jù)和有效途徑。