雙水相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定倒提壺中8種生物堿

樊輕亞，許衛(wèi)軍，代春美

(1.信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700)

倒提壺(CynoglossumamabileStapfetDrumm)是著名的藥用植物，以根及全草入藥，有清熱利濕、散瘀止血、止咳等功效[1-2]。倒提壺的主要成分是吡咯里西啶類生物堿，在臨床中有著非常重要的藥用價(jià)值[3-5]。姚志道[6]和買(mǎi)買(mǎi)素唐[7]等發(fā)現(xiàn)倒提壺生物堿治療神經(jīng)衰弱具有較好的療效。劉清華等[8]研究發(fā)現(xiàn)，毛果天芥菜堿對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤系統(tǒng) Walker-256 系統(tǒng)有顯著活性。陳昭文等[9]研究發(fā)現(xiàn)綠花倒提壺堿(Virdiflorine)具有增強(qiáng)小鼠心肌耐缺氧作用。Pandey 等[10]發(fā)現(xiàn)天芥菜堿能顯著降低尼古丁所致的神經(jīng)節(jié)激動(dòng)效應(yīng)，而刺凌德草堿(Echinatine)不僅有神經(jīng)節(jié)阻滯作用，還能增強(qiáng)腎上腺素的升壓作用。因此，研究倒提壺中生物堿具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

雙水相萃取系統(tǒng)(Aqueous two-phase system，ATPS)是由兩種化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的親水性聚合物，或一種親水性聚合物、低分子量親水性有機(jī)溶劑與無(wú)機(jī)鹽在水中以適當(dāng)濃度而形成的互不相容的兩水相系統(tǒng)，利用目標(biāo)物在兩相中的不同分配特性從而實(shí)現(xiàn)分離[11-12]。雙水相體系最早發(fā)現(xiàn)于1896 年，經(jīng)過(guò)近半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，雙水相萃取技術(shù)已應(yīng)用于生物、食品、醫(yī)藥以及稀有金屬的分析[13-15]。近年來(lái)雙水相體系發(fā)展迅速，在中藥有效成分的萃取分離中逐漸得到應(yīng)用，顯示了良好的應(yīng)用前景[16-19]。由于其具有操作環(huán)境溫和，不改變目標(biāo)物質(zhì)的生物活性，避免了使用有機(jī)溶劑，且操作條件簡(jiǎn)單，節(jié)約成本，符合綠色化學(xué)的發(fā)展要求，因此是一種具有極大發(fā)展前景的萃取技術(shù)。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)具有較高的靈敏度、選擇性和重現(xiàn)性，可確保復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)分析物的準(zhǔn)確定量[20-22]。本文首次將雙水相萃取技術(shù)引入中藥材倒提壺中有效成分的分離，采用 UHPLC-MS/MS技術(shù)建立了倒提壺中8種生物堿(天芥菜品、毛果天芥菜堿、綠花倒提壺堿、天芥菜堿、天芥菜定、刺棱德草堿、仰臥天芥菜堿、歐天芥菜堿)含量測(cè)定的方法，從而為更加全面地控制倒提壺藥材的質(zhì)量，開(kāi)發(fā)倒提壺制劑提供了可靠依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

DFY-200搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司)；美國(guó) Waters Xevo TQ-MS型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源；天芥菜品、毛果天芥菜堿、綠花倒提壺堿、天芥菜堿、天芥菜定、刺棱德草堿、仰臥天芥菜堿、歐天芥菜堿對(duì)照品(純度為98.5%，武漢ChemFaces有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)默克公司)。實(shí)驗(yàn)用倒提壺藥材均購(gòu)于網(wǎng)絡(luò)藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為倒提壺(CynoglossumamabileStapfetDrumm)全草。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乙醇回流法提取生物堿稱取一定量粉碎過(guò)100目篩的倒提壺藥材，加4倍量95%乙醇回流3次，每次1.5 h，過(guò)濾，濾液合并，濃縮，備用。

1.2.2 雙水相體系的配制稱取一定量的K2HPO4·3H2O，加入一定量的水，超聲溶解，加入30%乙醇，振搖，靜置，使形成乙醇/磷酸氫二鉀雙水相體系。

1.2.3 雙水相法萃取提取液(ATPE)取經(jīng)“1.2.1”提取后的倒提壺生物堿粗提液浸膏，用鹽酸或氨水分別調(diào)節(jié)水相 pH 值。加入EtOH/K2HPO4·3H2O雙水相溶液，25 ℃下超聲萃取20 min，取上清液，轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層后，取上層有機(jī)相待測(cè)。

1.2.4 溶劑法萃取提取液(SE)取經(jīng)“1.2.1”提取后的倒提壺生物堿粗提液浸膏，用稀鹽酸溶液超聲溶解后置于分液漏斗中，氯仿萃取后，旋干，用甲醇定容后，待測(cè)。

1.2.5 反膠束法萃取提取液(RME)[23]取經(jīng)“1.2.1”提取后的倒提壺生物堿粗提液浸膏，以 KCl調(diào)節(jié)水相的離子強(qiáng)度，加入4倍體積的二(2-乙基己基)磷酸酯/二(2-乙基己基)丁二酸酯磺酸鈉(DOLPA/AOT)-異辛烷反膠束溶液，電磁攪拌萃取后取上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至一錐形瓶中，加入等體積的水，室溫下進(jìn)行電磁攪拌反萃取 30 min后，轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層，取下層水相待測(cè)。

1.2.6 對(duì)照品溶液的制備精密稱取8種對(duì)照品各10.0 mg，分別用甲醇溶解并定容至10 mL，得各對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別吸取儲(chǔ)備液各1 mL，置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容后即得混合對(duì)照品溶液。

1.3 樣品分析條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BHE C18(50 mm×2.1 mm，1.7μm，美國(guó)Waters公司)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1 mol/L醋酸銨(B)，梯度洗脫程序:0～2 min，5%～15%A；2～7 min，15%～40%A;7～10 min，40%～80%A;10～12 min，80%～5%A；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：3 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源：ESI；檢出模式：正離子模式；離子源溫度：100 ℃；質(zhì)量掃描范圍：10～600m/z；干燥氣(N2)流速：10.0 L/min；干燥氣溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；錐孔氣流量：50 L/h；碰撞氣流量：2.5 L/h。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙水相體系的篩選及萃取條件的優(yōu)化

影響雙水相萃取的因素較多，為了篩選合適的雙水相體系，本文采用單因素實(shí)驗(yàn)方法考察乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)、萃取劑與樣品的相比、水相體系的pH值等萃取條件，研究了各萃取條件對(duì)倒提壺中8種生物堿萃取率的影響。

2.1.1 雙水相體系成相物質(zhì)的篩選將無(wú)水乙醇與不同的無(wú)機(jī)鹽按一定比例混合，按是否成相及成相的難易程度，成相范圍的寬窄等為指標(biāo)，初步篩選雙水相的成相物。實(shí)驗(yàn)考察了不同無(wú)機(jī)鹽(NH4)2SO4、K2HPO4·3H2O、Na2CO3、CaCl2、Na2SO4、NaCl與乙醇形成雙水相的性質(zhì)，結(jié)果顯示，K2HPO4·3H2O、(NH4)2SO4能與無(wú)水乙醇形成穩(wěn)定的雙水相體系，而Na2CO3、Na2SO4雖然也能與無(wú)水乙醇形成雙水相，但成相范圍很窄，下相容易產(chǎn)生沉淀，其他無(wú)機(jī)鹽則不能與無(wú)水乙醇形成雙水相體系。

進(jìn)一步采用濁點(diǎn)滴定法繪制EtOH/(NH4)2SO4與EtOH/K2HPO4·3H2O兩種雙水相體系的相圖。由實(shí)驗(yàn)可知，在醇的質(zhì)量濃度較小時(shí)，分相所需的無(wú)機(jī)鹽的量較大，乙醇/K2HPO4雙水相體系比EtOH/(NH4)2SO4體系的分相曲線更接近原點(diǎn)，在鹽質(zhì)量濃度相同的情況下僅需較少的醇即可形成雙水相體系，說(shuō)明EtOH/K2HPO4·3H2O比EtOH/(NH4)2SO4更易形成雙水相，故本實(shí)驗(yàn)選擇EtOH/K2HPO4·3H2O雙水相體系進(jìn)行后續(xù)研究。

2.1.2 EtOH和K2HPO4·3H2O的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)8種生物堿萃取率的影響EtOH/K2HPO4·3H2O雙水相體系的成相原理為乙醇與鹽之間對(duì)水分子的締合競(jìng)爭(zhēng)，因此醇與鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)體系的構(gòu)成與性質(zhì)，以及目標(biāo)物的萃取都具有極大的影響。兩相質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化會(huì)改變體系的成相行為，進(jìn)而影響生物堿在兩相中的分配。在實(shí)驗(yàn)條件下，調(diào)節(jié)萃取劑與樣品相比為6∶1，萃取劑pH值為4.0，對(duì)無(wú)水乙醇和K2HPO4·3H2O的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1A可知，固定K2HPO4·3H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，8種生物堿的萃取率隨乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大呈先增大后降低趨勢(shì)，且當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，8種生物堿的提取率最大。這是因?yàn)橐掖急壤龃髸r(shí)，分相范圍增大，有利于倒提壺生物堿的分配及萃取。但當(dāng)乙醇比例大于30%時(shí)，下相有晶體析出，體系不穩(wěn)定，所以萃取率下降，因而選30%乙醇作為最佳比例。

由圖1B可知，固定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，倒提壺生物堿的萃取率隨著K2HPO4·3H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈先增大后減小趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著K2HPO4·3H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，分相能力也增大，倒提壺中的生物堿更易增溶到上相中，故萃取率升高，當(dāng)K2HPO4·3H2O的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)20%時(shí)，分子間相應(yīng)碰撞增加，分相時(shí)間延長(zhǎng)，上相體積減小，溶液中分子間的作用力增大，使得生物堿分子不易進(jìn)入上相。此外，K2HPO4·3H2O的加入量較多時(shí)，鹽較難完全溶解，不利于物質(zhì)在相間的擴(kuò)散，故萃取率先增大后減小。最終確定K2HPO4·3H2O的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 20%。

圖2 雙水相萃取劑與樣品的相比對(duì)倒提壺中8種生物堿萃取率的影響Fig.2 Effect of aqueous two-phase and sample ratios on extraction efficiencies of 8 alkaloids from Cynoglossum amabile Stapf et Drumm1.heliotrine；2.lasiocarpine；3.heliotridine；4.supinine；5.echinatine ；6.heliosupine；7.virdiflorine；8.europine

圖3 萃取劑pH值對(duì)倒提壺中8種生物堿萃取率的影響Fig.3 Effect of pH value on extraction efficiencies of 8 alkaloids from Cynoglossum amabile Stapf et Drumm1.heliotrine；2.lasiocarpine；3.heliotridine；4.supinine；5.echinatine ；6.heliosupine；7.virdiflorine；8.europine

2.1.3 萃取劑與樣品相比對(duì)8種生物堿萃取率的影響萃取劑與樣品的相比會(huì)影響固相和液相之間的傳質(zhì)推動(dòng)力。取“1.2.1”提取后的生物堿儲(chǔ)備液，分別加入Et(OH)(30%)/K2HPO4·3H2O(20%)雙水相萃取劑，調(diào)節(jié)萃取劑pH值為4.0，按萃取劑與樣品的相比分別為1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1時(shí)考察萃取物體積與雙水相萃取劑用量的相比對(duì)萃取率的影響(見(jiàn)圖2)。結(jié)果顯示，隨著萃取劑用量的增大，倒提壺生物堿的萃取率逐漸增大，當(dāng)萃取劑和樣品相比為6∶1時(shí)，萃取劑基本可將倒提壺中的生物堿萃取完全，繼續(xù)增加萃取劑，萃取效率變化不大。這是因?yàn)橐毫媳仍叫?，兩相間的濃度差越小，從而傳質(zhì)推動(dòng)力就越小，所以萃取率較低。隨著液料比的提高，傳質(zhì)推動(dòng)力得到提高，但成本也相應(yīng)增加，萃取劑與樣品相比大于6∶1時(shí)，萃取率已無(wú)明顯變化，綜合考慮，最終選擇萃取劑與樣品的最佳配比為6∶1。

2.1.4 不同pH值對(duì)8種生物堿萃取率的影響pH值的改變會(huì)影響磷酸鹽的解離，從而影響EtOH/K2HPO4·3H2O體系的相間電位和物質(zhì)的分配系數(shù)，同時(shí)物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)也會(huì)隨pH值的變化而變化。取“1.2.1”提取后的生物堿儲(chǔ)備液，分別加入Et(OH)(30%)/K2HPO4·3H2O(20%)雙水相萃取劑，并使萃取劑與樣品的體積比為6∶1，通過(guò)采用氨水調(diào)節(jié)萃取劑的 pH值，考察了不同pH值對(duì)倒提壺中生物堿萃取效果的影響。由圖3可知，生物堿的萃取率隨著水相pH值的升高而增加，在pH 值4.0時(shí)，萃取率最大，隨著 pH 的繼續(xù)增大，溶液中帶正電荷的生物堿離子逐漸減少，生物堿主要以游離分子存在(pH 8.0)，其與EtOH/K2HPO4·3H2O間的靜電引力逐漸降低，從而導(dǎo)致其萃取率也逐漸降低，當(dāng)pH為12.0時(shí)，萃取率幾乎為0，因此實(shí)驗(yàn)選擇最佳pH值為4.0。

綜上所述，采用EtOH/K2HPO4·3H2O萃取倒提壺中生物堿，最佳萃取條件為30%乙醇/20%K2HPO4·3H2O，萃取劑pH值為4.0，萃取劑與樣品相比為6∶1。

圖4 藥用倒提壺經(jīng)雙水相萃取后的提取液總離子流圖Fig.4 TIC chromatogram of extract from Cynoglossum amabile Stapf et Drumm by aqueous two-phase extraction1.heliosupine；2.lasiocarpine；3.virdiflorine；4.heliotrine；5.heliotridine；6.echinatine；7.supinine；8.europine

2.2 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化對(duì)倒提壺雙水相萃取后提取液進(jìn)行UHPLC分析，采用乙腈、甲醇與不同濃度氨水、醋酸銨的不同配比作為流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈作為流動(dòng)相時(shí)峰形更加尖銳，在流動(dòng)相中加入一定比例的醋酸銨可以改善峰形和提高離子化效率，且醋酸銨為揮發(fā)性物質(zhì)，可減少對(duì)色譜柱的損害。因此，實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-0.1 mol/L醋酸銨溶液為流動(dòng)相，在優(yōu)化的梯度洗脫條件下，8種目標(biāo)化合物可以得到良好分離，且各色譜峰的峰形好、峰對(duì)稱、柱效高，所得總離子流圖如圖4所示。

2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化分別用質(zhì)譜電噴霧電離源正離子模式和負(fù)離子模式對(duì)8種生物堿進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式下幾乎無(wú)質(zhì)譜響應(yīng)，因此選擇 ESI(+)作為離子化模式，分別找出這8種化合物的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，并對(duì)干燥氣體、霧化氣壓力、干燥氣流量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，然后對(duì)母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，選擇2個(gè)信噪比較高的特征子離子分別作為定量和定性離子對(duì)，8種化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。在ESI(+)-MS/MS條件下，8種化合物主要發(fā)生側(cè)鏈酯鍵的斷裂和吡咯里西啶母核與整個(gè)側(cè)鏈的斷裂，8種化合物的質(zhì)譜裂解途徑見(jiàn)圖5。

表1 8種生物堿的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 8 alkaloids

圖5 8種生物堿的質(zhì)譜裂解途徑Fig.5 Fragmentation pathways of 8 compounds alkaloids1.heliosupine；2.lasiocarpine；3.virdiflorine；4.heliotrine；5.heliotridine；6.echinatine；7.supinine；8.europine

2.3 線性范圍、檢出限與加標(biāo)回收率

取8種生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配制成一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品，按“1.2.3”方法進(jìn)行雙水相萃取，按“1.3”方法進(jìn)行測(cè)定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度(X，mg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程，按信噪比S/N=3，計(jì)算檢出限。精密稱取已測(cè)定含量的倒提壺樣品，分別向其添加低、中、高 3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平做6個(gè)平行，計(jì)算其平均回收率。8種生物堿的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及實(shí)際樣品加標(biāo)回收率結(jié)果見(jiàn)表2。由表可知，8種生物堿在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，檢出限為0.03～0.10 mg/L，8種生物堿的回收率為91.5%～97.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于3.0%，方法體現(xiàn)了較高的精密度和準(zhǔn)確度。

表2 8種生物堿的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、線性范圍、檢出限，及其在實(shí)際樣品中的回收率Table 2 Calibration curves, linear ranges and detection limits of 8 alkaloids， and their recoveries in real sample

2.4 穩(wěn)定性與重復(fù)性

精密稱取倒提壺藥材細(xì)粉6份，按實(shí)驗(yàn)方法分別進(jìn)行萃取、處理和測(cè)定，取樣品和對(duì)照品溶液于室溫下放置0～24 h后，進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明穩(wěn)定性和重復(fù)性的RSD均小于2.0%，方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.5 萃取分析及應(yīng)用

精密稱取3個(gè)產(chǎn)地的倒提壺藥材各100 g，采用雙水相萃取在最優(yōu)條件下萃取藥材中的生物堿，按“1.3”方法測(cè)定其含量，并與“1.2.4”溶劑萃取法及“1.2.5”反膠束萃取法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同產(chǎn)地倒提壺藥材8種生物堿的提取分析結(jié)果(n=3)Table 3 Analytical results of 8 alkaloids from Cynoglossum amabile Stapf et Drumm obtained with different origins(n=3)

由表3可知，與傳統(tǒng)的溶劑萃取技術(shù)以及反膠束萃取技術(shù)相比，經(jīng)EtOH/K2HPO4·3H2O雙水相萃取后,倒提壺中各種生物堿的萃取效率為傳統(tǒng)溶劑萃取法的2.5倍左右，比反膠束萃取法高20%左右。此外，傳統(tǒng)溶劑萃取法操作復(fù)雜、萃取效率低，且有機(jī)溶劑用量大、殘留多。反膠束萃取法也需使用有機(jī)溶劑，且萃取效率低于雙水相法。由此可見(jiàn)，雙水相萃取技術(shù)的操作簡(jiǎn)單、萃取效率高，且避免使用有機(jī)溶劑、成本低，是一種實(shí)用的綠色環(huán)保萃取分離技術(shù)。此外，本文采用UHPLC-MS/MS檢測(cè)方法具有分析時(shí)間短(10 min)、溶劑消耗少等特點(diǎn)。因此，本文所建立的分析方法適用于該中藥材多指標(biāo)成分的定量檢測(cè)。

從表3還可以看出，在所有產(chǎn)地的倒提壺中以天芥菜堿的含量最高，毛果天芥菜堿次之。此外，不同產(chǎn)地倒提壺中的生物堿含量分布明顯不同，其中云南產(chǎn)倒提壺中生物堿含量明顯高于其他2個(gè)產(chǎn)地。因此，在提取倒提壺中生物堿有效活性成分時(shí)，應(yīng)根據(jù)不同產(chǎn)地、氣候及環(huán)境選擇原料，以獲得更高的提取率。

3 結(jié) 論

本文將EtOH/K2HPO4·3H2O雙水相萃取技術(shù)應(yīng)用于倒提壺中生物堿的萃取，并優(yōu)化了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定生物堿含量的條件。本萃取方法利用水作為萃取體系，避免使用或盡可能少使用有機(jī)溶劑，可選擇性地將目標(biāo)生物堿與其他雜質(zhì)進(jìn)行分離，萃取效率高，易于工藝放大和連續(xù)操作，且溶劑可以循環(huán)利用，降低了環(huán)境污染，是一種具有極大發(fā)展前景的萃取技術(shù)。進(jìn)一步采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定倒提壺中生物堿的含量，實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同產(chǎn)地倒提壺中生物堿含量的檢測(cè)和評(píng)價(jià)。該方法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確靈敏，可為倒提壺制劑的開(kāi)發(fā)及質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。