薛磊 鄭澤浩 郭志剛 王穎 郭斌 陳煒 姜影影 來航線

摘??要：為研究煙草增香細菌對煙葉吸食品質(zhì)的影響，以云南主要煙草種植區(qū)的根際土壤和新鮮煙葉為微生物分離源，對菌株產(chǎn)酶和降解功能進行篩選，并對煙絲發(fā)酵樣感官質(zhì)量和香味成分進行分析。結(jié)果表明，從供試云南微生物分離源樣品中分離、篩選到一株可同時產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶，并可降解β-胡蘿卜素的復(fù)合功能型菌株YN14;與對照相比，菌株YN14發(fā)酵樣的煙氣細膩度有改善，香氣質(zhì)和香氣量均有增加，甜感有增加，刺激減小;GC/MS分析結(jié)果也表明，YN14發(fā)酵樣煙氣中香味物質(zhì)含量明顯增加。菌株YN14經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）細菌。綜上所述，芽孢桿菌YN14具產(chǎn)多種酶和降解功能，并可明顯改善煙草吸食品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：煙草;煙絲發(fā)酵;增香微生物;芽孢桿菌;煙葉品質(zhì)

中圖分類號：S435.72 ?????????文章編號：1007-5119（2019）05-0060-08 ?????DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.05.009

Abstract： In order to study the effect of aroma-enhancing bacteria?on smoking quality of tobacco， the rhizosphere soil and fresh tobacco leaves of the main tobacco-producing areas in Yunnan were used as the microbial sources. The multiple enzyme activities and degradation functions of the?bacteria?were screened， and the smoking quality and aroma components of the tobacco were analyzed after microbial fermentation. The results showed that： A complex functional strain YN14 which can simultaneously produce protease， amylase and cellulose， and degrade β-carotene was isolated and screened from the microbial sources in Yunnan. Compared with the control， the fineness and sweetness of the smoking of YN14?treated?samples?were improved， aroma quality and amount were increased; and the stimulation was decreased. The results of GC/MS analysis also showed that the content of aroma in smoke increased significantly in YN14?treated?samples. The strain YN14 was identified?asBacillussp..?In conclusion， theBacillusstrain YN14 has a variety of enzyme activities and degradation functions， and can significantly improve the smoking quality of tobacco.

Keywords：tobacco; fermentation; aroma-enhancing microorganism;Bacillus; quality of tobacco

煙葉發(fā)酵在煙葉生產(chǎn)過程中具有重要地位，在煙葉發(fā)酵過程中，煙葉會發(fā)生一系列復(fù)雜的物理、化學(xué)變化，使得煙葉中部分大分子化合物降解轉(zhuǎn)化為具香味特性的化合物，從而影響煙葉吸味品質(zhì)^[1]。

煙葉表面存在著大量的微生物，其在整個煙葉發(fā)酵過程中對煙葉品質(zhì)改善發(fā)揮著巨大作用^[2]。因此，將微生物應(yīng)用于煙葉人工發(fā)酵，不僅可縮短發(fā)酵周期，還可改善煙葉品質(zhì)^[3]。近年來國內(nèi)外關(guān)于利用微生物改善煙葉品質(zhì)的研究也有報道。如利用煙堿降解微生物降低煙葉煙堿含量，改善勁頭^[4-6]?；蚶梦⑸飦斫档蜔熑~蛋白質(zhì)含量，減少煙葉燃燒時由蛋白產(chǎn)生的焦味^[7]。也有研究通過微生物降解煙葉淀粉，提升煙葉總糖和還原糖含量，來提升煙葉品質(zhì)^[8]。此外利用產(chǎn)纖維素酶菌株也可降低煙葉中纖維素含量以減少煙氣的辛辣感和刺激性^[9-11]。但這些研究僅針對具有產(chǎn)單一酶或降解特性的微生物菌株，對于同時產(chǎn)多種酶的煙草增香微生物及其對煙葉品質(zhì)改善作用的研究報道較少。

因此，本研究通過對云南典型煙草種植區(qū)域的微生物資源進行分離收集，并對其產(chǎn)多種酶能力、降解特性和煙絲發(fā)酵效果進行篩選，研究其對煙葉品質(zhì)的影響，探討將其應(yīng)用于煙草發(fā)酵的可能，為煙草增香微生物資源的發(fā)掘及其工業(yè)應(yīng)用提供技術(shù)指導(dǎo)與依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

樣品來源：2017年采自云南省昆明、玉溪、曲靖、大理、保山、文山州、楚雄等地市典型煙草種植區(qū)的23份新鮮煙葉樣品和23份根際土樣。

供試煙絲：陜西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司的低等級配方葉組煙絲，煙絲水分含量為12%。

1.2 ?試劑和培養(yǎng)基

試驗試劑：Mix、Marker購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，通用引物等購自生工生物工程（上海）股份有限公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

分離培養(yǎng)基^[12]：細菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌采用PDA培養(yǎng)基，放線菌采用高氏1號培養(yǎng)基。菌種液體培養(yǎng)采用LB液體培養(yǎng)基。

產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基：蛋白酶篩選培養(yǎng)基^[13]，淀粉酶篩選培養(yǎng)基^[14]，纖維素酶篩選培養(yǎng)基^[15]。

β-胡蘿卜素液體培養(yǎng)基：K₂HPO₄1.0 g/L，MgSO₄0.5 g/L，NaNO₃3.0 g/L，F(xiàn)eSO₄0.01 g/L，KCl 0.5 g/L，蔗糖30.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，β-胡蘿卜素2.0 g/L。

1.3 ?煙葉表面微生物分離

稱取新鮮煙葉或土壤樣品10.0 g，采用逐級稀

釋法^[13]，挑取單菌落，純化后備用。

1.4 ?煙用菌株的活性篩選

1.4.1 ?產(chǎn)酶和降解特性篩選試驗??將分離到的菌株初步鑒定去重后，點接于產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，以確定菌株產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶或蛋白酶的功能，并測量菌株周圍透明水解圈和菌落直徑（淀粉酶平板需碘液染色，纖維素酶平板需剛果紅溶液染色）^[13-15]，計算酶活比值：

酶活比值=（水解圈直徑?菌落直徑）/菌落直徑

β-胡蘿卜素降解試驗^[16]：將菌株接種于β-胡蘿卜素液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)72 h，將菌液離心后，依據(jù)上清液吸光值與未接種對照的變化確定β-胡蘿卜素降解能力。

1.4.2 ?菌株增香發(fā)酵與感官評吸??選取產(chǎn)酶和降解篩選試驗表現(xiàn)較好的菌株，將單菌株接種于LB培養(yǎng)液中，37 ℃、160 r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24 h。菌液于4 ℃、8000 r/min離心10 min，將收集的單菌株菌體用無菌水配制成菌懸液，均勻噴灑在供試煙絲表面，以等量無菌水處理做對照，置于37?℃、濕度80%的恒溫恒濕箱中發(fā)酵培養(yǎng)48?h后，將煙絲烘干至水分為12%，備用。

將發(fā)酵后的煙絲樣品在25 ℃、相對濕度65%條件下平衡24 h，卷制成卷煙。由具有卷煙感官評吸技術(shù)資格的7人組成感官評吸評委組采用整體循環(huán)法進行感官質(zhì)量綜合評價^[17-18]。

1.5 ?理化指標(biāo)和致香成分測定

理化指標(biāo)檢測：參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T?159—2002、YC/T?160—2002、YC/T?162—2002、YC/T?173—2003 及YC/T?161—2002對煙絲中總糖和還原糖、煙堿、氯、鉀和總氮進行檢測。

致香成分測定：挑選重量、吸阻符合要求的煙支，在標(biāo)準(zhǔn)抽吸條件下通過吸煙機抽吸，對樣品主流煙氣中的粒相物用濾片進行捕集，將濾片捕集物萃取濃縮至一定體積后進行GC/MS分析。GC/MS色譜條件：

色譜柱：DB-35MS彈性石英毛細管柱（60 m?×?0.32 mm?×?0.25 μm）;進樣量：1 μL;進樣口溫度：240 ℃;載氣：He;流速：1 mL/min;接口溫度：

250 ℃;升溫梯度：從初始溫度50 ℃保持2 min，以3 ℃/min升溫至160 ℃，保留1 min，再以4 ℃/min升溫至280 ℃，保留時間20 min;離子源：EI源;電子能量：70 eV;掃描范圍：35～455 amu;圖譜庫：NBS，WILEY標(biāo)準(zhǔn)譜庫。

1.6 ?煙葉微生物的鑒定

唯一碳源利用試驗參考張紀(jì)忠^[19]的方法，常用碳源按1%比例加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。采用酶法提取菌株DNA，擴增16S rRNA基因序列，（通用引物：27F，5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';1492R，

5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。將測序結(jié)果在EzBioCloud庫中比對，Clustal X 2.1進行同源性分析，Mega 5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Neighbor-Joining法）。

1.7??數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel和DPS 7.05軟件進行數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計分析。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?樣品中微生物分離與鑒定

從供試煙葉和土壤樣品中共分離得到可培養(yǎng)細菌284株，真菌65株，放線菌102株，細菌數(shù)量最多，故細菌為樣品中的優(yōu)勢微生物類群。

提取細菌菌株DNA，擴增16S rRNA基因序列（圖1），進行同源性比對去重后為96種細菌。核苷酸序列比對結(jié)果表明，從供試煙葉和土壤樣品中分離得到的可培養(yǎng)細菌主要包括Bacillussp.、Chryseobacteriumsp.、Enterobactersp.、Erwiniasp.、Paenarthrobactersp.、Pseudomonassp.等27個不同的屬。其中芽孢桿菌屬（Bacillussp.）包含有34個不同的種，數(shù)量最多，出現(xiàn)頻次較高的有：B. altitudinis、B. JH792383_s、B. muralis、B.CP013984_s、B. halotolerans、B. subtilis subsp.Inaquosorum、B. aryabhattai、B. megaterium、B. weihenstephanensis、B. zhangzhouensis等。從而確定芽孢桿菌屬（Bacillussp.）為云南煙葉和土壤樣品中可培養(yǎng)細菌中的優(yōu)勢種群。

2.2 ?菌株的產(chǎn)酶和降解特性篩選

產(chǎn)酶和降解特性篩選試驗表明（圖2），多數(shù)細菌具有產(chǎn)胞外酶功能，但產(chǎn)酶功能不同，其中6株酶活性表現(xiàn)較好的菌株如表1所示。供試6株菌均可產(chǎn)淀粉酶，其中菌株YN10產(chǎn)淀粉酶能力相對較強，其酶活比值達2.17，遠高于其余菌株;具產(chǎn)蛋白酶功能的菌株為YN14、YN15和YN17;具產(chǎn)纖維素酶功能的菌株有YN10、YN11、YN14和YN16，其中產(chǎn)纖維素酶能力最強的為YN14，其酶活比值達5.00;表中6株菌均可降解β-胡蘿卜素，其中降解效果最好的為YN15，降解率達39.39%。菌株YN14同時具備產(chǎn)3種酶的能力，并可降解β-胡蘿卜素，綜合表現(xiàn)最好。

2.3 ?菌株發(fā)酵后煙葉感官質(zhì)量變化

由表2看出，不同菌株對煙葉感官質(zhì)量各指標(biāo)影響存在一定差異。與對照相比，菌株YN10和YN15可增加煙氣香氣量，但香氣質(zhì)與對照未見有明顯提升，且余味有不舒適感;菌株YN11和YN17處理樣煙氣的細膩度和香氣質(zhì)有改善，但煙氣濃度和香氣量與對照相比有下降，且YN17處理樣的煙氣對喉部刺激性較大，余味改善不明顯;YN16處理樣與對照相比香氣質(zhì)稍有改善，但喉部刺激和余味不舒適感增加。綜合比較，菌株YN14處理樣與對照相比煙氣細膩度改善，香氣質(zhì)和香氣量均有增加，甜感有增加，刺激性減小，總體感官質(zhì)量提升最為明顯。

2.4 ?菌株發(fā)酵后煙葉化學(xué)成分和香味成分變化

如表3所示，與對照相比，經(jīng)各增香菌株發(fā)酵后，煙絲化學(xué)成分中總糖、還原糖、總氮含量有明顯變化，煙堿、氯和鉀含量變化不大。其中，菌株YN15、YN14和YN10的總糖和還原糖含量較對照明顯增加，煙葉糖堿比增高;菌株YN11和YN17的還原糖含量雖較對照有增高，但總糖含量下降;菌株YN16的總糖和還原糖含量均較對照有下降，糖堿比下降。此外，菌株YN16和YN17的總氮含量較對照稍有增加，而YN11、YN14和YN15的總氮含量較對照稍有下降。

GC/MS分析結(jié)果表明，總體感官質(zhì)量提升最為明顯的菌株YN14處理樣和對照樣的煙氣中共同檢測出香味化合物76種，菌株YN14處理樣煙氣中香味成分總含量較對照提升33.24%。如圖3所示，菌株YN14在醇類、酯類、酚類、酸類、酮類、醛類和烯類香味成分含量均有增加，其中，醇類較對照提升了104.28%，酯類增加了67.29%。其中，具香味化合物如乙酸乙酯、糠醇、5-甲基-2-呋喃甲醛、2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、4-乙基-苯酚、吲哚、3-甲基-1H-吲哚、2，3-二氫-2-甲氧苯并呋喃、2，3-二吡啶、巨豆三烯酮、3-氧代-α-紫羅蘭醇、新植二烯、植醇、豆甾烷-3，5-二烯、豆甾醇和巨豆三烯酮等的含量較對照樣有著不同程度的提高（表4）。并且，煙草常見的香味成分如巨豆三烯酮總量較對照提升了30.89%，3-氧代-α-紫羅蘭醇含量提升了164.27%。

2.5 ?增香菌株鑒定

供試14種唯一碳源利用試驗結(jié)果表明，菌株YN14可利用果糖、麥芽糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、纖維二糖、木聚糖、海藻糖、核糖、衛(wèi)矛醇和肌醇作為唯一碳源生長，不能利用甘露醇和山梨醇作為唯一碳源生長。表明菌株YN14可利用碳源范圍較廣。

菌株YN14擴增到的16S rRNA基因序列測序片段長度為1006 bp。16S rRNA基因序列相似性比對結(jié)果表明菌株YN14和BacillusNVLJ_s相似度最高，為99.89%，與其余芽孢桿菌的相似度為99.78%或99.66%。系統(tǒng)發(fā)育樹圖中菌株YN14和BacillusNVLJ_s也處于同一系統(tǒng)進化分枝上（圖4）。

結(jié)合菌株的生長形態(tài)、碳源利用等特性及16S rRNA序列分析結(jié)果，將產(chǎn)多種酶和降解特性及煙絲發(fā)酵效果均較好的菌株YN14初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）細菌。

3 ?討??論

云南地區(qū)是我國重要的煙草種植區(qū)域，近年來關(guān)于該地區(qū)的煙草微生物資源研究也有報道，但這些研究多針對云南植煙區(qū)域土壤或煙葉的微生物數(shù)量、種群和部分菌株產(chǎn)酶特性篩選^[20-23]，而對于云南地區(qū)微生物資源應(yīng)用于煙葉品質(zhì)改善方面的研究報道較少。本研究不僅對云南主要典型植煙區(qū)的微生物資源進行挖掘，并對其在煙葉品質(zhì)改善作用方面進行了進一步研究。

目前，將煙葉表面分離到的微生物應(yīng)用于煙葉發(fā)酵中，以提高煙葉內(nèi)在品質(zhì)、降低煙葉有害成分，是煙草行業(yè)的熱點研究方向^[24]。近年來研究表明，微生物在進行生長代謝時，可通過生物酶的催化作用直接或間接導(dǎo)致煙葉中物質(zhì)的分解與合成，進而改善煙葉質(zhì)量^[25]。與現(xiàn)有利用具產(chǎn)單一酶或降解特性的微生物^[6-9]進行發(fā)酵改善煙葉品質(zhì)的研究不同，本研究從具產(chǎn)多種酶和降解特性的微生物及其改善煙葉整體感官質(zhì)量角度開展，篩選到一株可同時產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶并可降解β-胡蘿卜素的復(fù)合功能型菌株YN14，其對煙葉品質(zhì)具有明顯的提升效果，這一結(jié)果也為該類研究提供了新的研究思路。

菌株YN14可能的作用機理在于，其所具備的同時產(chǎn)多種酶特性，在煙絲發(fā)酵過程中，可通過降解煙葉中的蛋白質(zhì)、淀粉和纖維素等大分子物質(zhì)，產(chǎn)生糖類和氨基酸等降解產(chǎn)物，在后續(xù)煙絲加熱干燥過程中，煙絲中的糖類和氨基酸可作為反應(yīng)底物經(jīng)由美拉德反應(yīng)^[26]使得如糠醇、5-甲基-2-呋喃甲醛、2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮等^[27]具香味的反應(yīng)產(chǎn)物含量增加。同時，YN14菌株具有降解β-胡蘿卜素的能力，而類胡蘿卜素類物質(zhì)是煙葉中重要的香氣前體物^[28]，發(fā)酵后類胡蘿卜素降解物如巨豆三烯酮、3-氧代-α-紫羅蘭醇、新植二烯等^[29]香味物質(zhì)含量的增加，也促進了煙氣的香氣質(zhì)量改善。此外，發(fā)酵處理后酸類、酚類、萜烯類、酯類和氮雜環(huán)類^[30-32]等不同化合物含量的增加，對香氣品質(zhì)提升也有一定的促進作用。總之，菌株YN14可通過上述途徑，使得煙氣中各類香味成分含量明顯增加，這對改善煙葉感官質(zhì)量起到了重要作用。

綜上所述，菌株YN14具同時產(chǎn)多種酶的能力和降解β-胡蘿卜素特性，其發(fā)酵煙樣表現(xiàn)出感官質(zhì)量明顯改善和香味物質(zhì)含量增加的效果。這對改善低等級煙葉品質(zhì)，提高煙葉卷煙工業(yè)可用性具有重要意義。

4 ?結(jié)??論

本研究結(jié)果表明，在云南省典型煙草種植區(qū)煙葉和根際土壤的可培養(yǎng)微生物中，細菌為優(yōu)勢微生物類群，優(yōu)勢種群為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）細菌。從中篩選到一株可同時產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶，降解β-胡蘿卜素綜合表現(xiàn)較好的芽孢桿菌屬菌株YN14，將其應(yīng)用于煙絲發(fā)酵后，對低等級煙葉感官質(zhì)量指標(biāo)如煙氣細膩度、香氣質(zhì)、香氣量、甜感、刺激性等方面有明顯改善，提升了煙氣中香味成分含量。今后將繼續(xù)圍繞分離到的微生物菌株開展產(chǎn)酶特性、發(fā)酵煙絲香氣成分變化規(guī)律、感官評吸結(jié)果等方面的規(guī)律開展深入研究。

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