施夏明，齊璐璐，喬寧寧，徐忠東，耿明

（1.合肥師范學(xué)院，安徽合肥230601；2.安徽大學(xué)，安徽合肥230039）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是無性繁殖作物，病毒和類病毒可通過種薯持續(xù)傳播給子代植株[1]，這是制約馬鈴薯現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，導(dǎo)致產(chǎn)量和質(zhì)量下降的主要因素。馬鈴薯X病毒（PVX）、Y病毒（PVY）、S病毒（PVS）、卷葉病毒（PLRV）、M 病毒（PVM）、A病毒（PVA）在我國及世界各地廣泛流行。我國馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)PVS、PVY感染情況尤為嚴(yán)重[2]。馬鈴薯病毒脫毒技術(shù)對于提高馬鈴薯產(chǎn)量和質(zhì)量至關(guān)重要?，F(xiàn)行的馬鈴薯脫毒技術(shù)主要包含莖尖分生組織培養(yǎng)法、熱療法、電療法、化學(xué)療法、冷凍療法。單獨(dú)或聯(lián)合使用上述方法，均取得了良好的脫毒效果。筆者綜述了國內(nèi)外馬鈴薯脫毒技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，為馬鈴薯脫毒技術(shù)的研究和推廣提供參考。

1 莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)

植物病毒通過在維管系統(tǒng)中的快速移動來侵染健康組織，而在未形成成熟維管系統(tǒng)的分生組織中，病毒只能在胞間連絲上緩慢傳輸來侵染組織[3]。此外，細(xì)胞分裂和病毒復(fù)制存在激烈競爭。在分生組織中，細(xì)胞分裂非常旺盛，需要消耗大量養(yǎng)分，而病毒復(fù)制由于得不到充足的營養(yǎng)而受到明顯抑制[4]。因此，植物的分生組織不含病毒。將植物的分生組織分離出來，進(jìn)行組織培養(yǎng)即可得到無病毒的脫毒苗。莖尖分生組織脫毒培養(yǎng)技術(shù)是應(yīng)用最為廣泛的一種脫毒方法。近年來，馬鈴薯莖尖脫毒技術(shù)的發(fā)展研究主要集中在不同產(chǎn)區(qū)、不同品種的莖尖脫毒培養(yǎng)基配方及莖尖剝離方式上[5-7]。莖尖脫毒培養(yǎng)基配方研究除了聚焦使用什么樣的激素及其配比來提高脫毒莖尖成活率外，還關(guān)注如何提高脫毒莖尖的成苗率。齊恩芳等在莖尖脫毒培養(yǎng)基中添加了0.05%活性炭，莖尖成苗時(shí)間提前了13 d，成苗率提升了7.5%[8]。盧艷麗等在莖尖培養(yǎng)基中添加了L-半胱氨酸鹽酸鹽，顯著抑制了組織褐變，且提高了成苗率[9]。

2 熱療法脫毒培養(yǎng)技術(shù)

熱療法的2個(gè)重要影響因素是溫度和熱療時(shí)間。熱療的原則是不損傷植物組織，但可以使植物病毒的衣殼蛋白變性，從而最大限度地殺死病毒。此外，熱療法還可能通過預(yù)防病毒向分生組織細(xì)胞運(yùn)動、抑制病毒復(fù)制、降解病毒RNA、促進(jìn)病毒RNA沉默、減少莖尖中病毒基因組積聚等方式來實(shí)現(xiàn)植物脫毒[10]。熱療法對馬鈴薯卷葉病毒最敏感[11]。Abbas等利用37℃熱水浸泡馬鈴薯塊莖2～3 h后，轉(zhuǎn)入大田播種，卷葉病毒發(fā)病率降至最小16.66%[12]。熱療法對其他馬鈴薯病毒，例如PVX、PVS也具有不同程度的抑制作用[13]。熱療法常常配合莖尖分生組織培養(yǎng)，可以顯著提高脫毒效率[10]。蔣瑜等對國際馬鈴薯中心提供的編號B13-6的發(fā)芽馬鈴薯塊先進(jìn)行37℃熱療30 d，然后進(jìn)行莖尖脫毒培養(yǎng)，結(jié)果顯示熱療可提高脫毒效果[14]。馮光惠等對含有PVX、PVY、PLRV、PSTVd（馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒）4種病毒的費(fèi)烏瑞它、夏波蒂馬鈴薯無菌苗先進(jìn)行每天38℃熱療4 h，持續(xù)4周，然后進(jìn)行莖尖脫毒培養(yǎng)，結(jié)果表明PLRV的脫除率均達(dá)到100%，PVX的脫除率均達(dá)到65%以上，PVY的脫除率均達(dá)到90%以上，最難脫除的類病毒PSTVd的脫除率也達(dá)到8%以上[15-16]。尹明華等采用莖尖培養(yǎng)與熱療法反復(fù)交互進(jìn)行，成功脫除了懷玉山地區(qū)高山馬鈴薯的PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV 病毒[6]。

3 電療法脫毒培養(yǎng)技術(shù)

電療法是一種高效、簡便、快速的脫毒技術(shù)方法。其通常將馬鈴薯莖尖、莖段、芽等外植體置于5～100 mA 的電流下，通電處理 5～25 min，然后移入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可在不影響外植體再生率的基礎(chǔ)上，較好地脫除病毒。電療法脫病毒的原理可能是通過電脈沖加熱植物組織，使病毒的核酸變性，從而達(dá)到殺滅病毒的療效[17-18]。馬鈴薯電療法脫毒技術(shù)在我國的運(yùn)用并不多見，而在國外，此技術(shù)方法的運(yùn)用較為廣泛。國外學(xué)者運(yùn)用此方法已成功脫除PVX[17，19]、PVY[20-23]、PLRV[23-24]、PVA[21]、PSTVd[24]。

4 化學(xué)療法脫毒培養(yǎng)技術(shù)

化學(xué)療法脫毒培養(yǎng)技術(shù)采用的化療藥物最常見的是利巴韋林。利巴韋林在1972年被人工合成，試驗(yàn)證據(jù)表明其可以抑制大多數(shù)動物RNA病毒和DNA病毒的復(fù)制，是高效的抗病毒藥物[25]。1982年Klein等為了獲取無PVX種苗，利用添加了利巴韋林的液體培養(yǎng)基來培養(yǎng)馬鈴薯莖尖，結(jié)果顯示10 μg/mL利巴韋林可以脫除80%～83%莖尖的PVX，6～8個(gè)月后莖尖發(fā)育成完整的植株。但是各種濃度的利巴韋林對植物生長均可產(chǎn)生毒害作用，當(dāng)利巴韋林的濃度達(dá)到 100 μg/mL 時(shí)，致死莖尖[26]。2008 年 Dhital等利用添加了20 mg/L利巴韋林的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)電療過后的馬鈴薯莖尖，相對于單一電療法，顯著增加了PLRV和PVY的脫毒率[23]。2014年Yang等將各自感染了 PVA、PLRV、PVS、PVX、PVY 的馬鈴薯小植株和混合感染了PVM、PVS、PVY的馬鈴薯小植株培養(yǎng)在含有不同濃度利巴韋林的MS培養(yǎng)基中，經(jīng)過2～3代的繼代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)75～150 mg/L利巴韋林可以高頻獲取脫毒種苗[27]。2015年Singh等將PLRV陽性的馬鈴薯外植體培養(yǎng)在含有5～30 mg/L利巴韋林的MS培養(yǎng)基中，結(jié)果顯示隨著利巴韋林濃度的增加，馬鈴薯植株的再生率顯著降低，脫毒率顯著增加，當(dāng)利巴韋林濃度達(dá)到25 mg/L時(shí)，再生率和脫毒率達(dá)到了最佳組合，再生率達(dá)到36.80%，脫毒率達(dá)到39.62%[28]。2017年Kushnarenko等將馬鈴薯莖尖冷凍處理后，再用含有利巴韋林的培養(yǎng)基培養(yǎng)3代，獲得了100%無毒馬鈴薯苗[29]。以上研究表明利巴韋林對廣泛流行的6種馬鈴薯病毒均有不同程度的抑制作用。

化學(xué)療法脫毒技術(shù)采用的化療藥物除了利巴韋林外，還有一些其他藥物的應(yīng)用實(shí)例，例如1 000 mg/L乳鐵蛋白通過噴霧法或者聯(lián)合組織培養(yǎng)法可有效抑制PVX[30]。富含25 mg/L 2-硫尿嘧啶的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)卷葉病毒陽性的馬鈴薯外植體，可得到30.55%的再生率和38.68%的脫毒率[28]。此外還有些化療藥物在脫毒的同時(shí)幫助提升植株的再生率，例如水楊酸預(yù)處理聯(lián)合冷凍療法可增強(qiáng)馬鈴薯植株的存活率并可清除PVS[31]。水楊酸聯(lián)合利巴韋林和電療法在有效清除PLRV和PVY的同時(shí)，顯著提升馬鈴薯苗的再生率，最高達(dá)72.7%[23]。

5 冷凍療法脫毒培養(yǎng)技術(shù)

相對于傳統(tǒng)的莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)，冷凍脫毒培養(yǎng)是一種更高效、更簡便的脫毒培養(yǎng)技術(shù)[32]。植物病毒量會隨著離頂端分生組織距離的減小而減少。頂端分生組織的細(xì)胞含有高濃度胞質(zhì)，而距離分生組織較遠(yuǎn)的莖尖細(xì)胞含有較多水分。在-196℃的冰凍條件下，水分含量大的細(xì)胞會被胞內(nèi)形成的冰晶崩解，而擁有高濃度胞質(zhì)的細(xì)胞可以抵抗冰凍。因此，低溫療法是基于超低溫對細(xì)胞選擇性破壞的原理，殺死帶有病毒且水分含量大的莖尖細(xì)胞，保存不含病毒或含少量病毒的分生組織細(xì)胞，結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)，而得到無毒種苗[33-34]。目前，國內(nèi)外科學(xué)家已采用馬鈴薯冷凍療法脫毒技術(shù)成功高效脫除了PVM、PVX、PVY、PVS、PLRV、PSTVd[29，31，35-39]。

6 結(jié)語

馬鈴薯品種繁多，馬鈴薯病毒的種類亦繁多。每一品種馬鈴薯感染的每一種病毒對每一種脫毒技術(shù)的敏感性均有不同，這就需要研究者深入尋找最佳的脫毒方案。此外，每一種脫毒技術(shù)均具有一定的局限性，需要研究者聯(lián)合2種或更多種的脫毒技術(shù)同時(shí)干預(yù)馬鈴薯病毒，使脫毒技術(shù)間優(yōu)勢互補(bǔ)，才能獲得理想的馬鈴薯脫毒種質(zhì)。例如，科學(xué)家運(yùn)用莖尖分生組織脫毒技術(shù)、冷凍脫毒技術(shù)、化學(xué)療法聯(lián)合熱療法脫毒技術(shù)分別對挪威當(dāng)?shù)?種傳統(tǒng)栽培品種馬鈴薯進(jìn)行脫毒試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)品種的馬鈴薯通過莖尖分生組織脫毒技術(shù)脫除病毒，沒有1個(gè)品種的馬鈴薯通過冷凍脫毒技術(shù)脫除病毒，而8個(gè)品種的馬鈴薯均通過化學(xué)療法聯(lián)合熱療法不同程度地脫除了病毒[40]。

馬鈴薯是全球第4大糧食作物，我國是最大的馬鈴薯生產(chǎn)國[41]。我國已啟動馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略。馬鈴薯種質(zhì)資源的脫毒情況嚴(yán)重影響我國馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)及糧食安全。因此，簡便易行、安全高效、脫毒周期短的脫毒技術(shù)研究和推廣是馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的必然要求。