環(huán)狀RNA在結(jié)直腸癌中的研究進(jìn)展

張宇宏，李云龍，李勝龍綜述 張博淼，黃躍南審校

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)癌癥發(fā)病居男性的第2位，女性的第3位[1]。當(dāng)結(jié)直腸癌被檢出時(shí)在局限階段的5年生存率為90.1%，癌癥擴(kuò)散到臨近器官和淋巴結(jié)時(shí)5年生存率下降到69.2%，當(dāng)疾病擴(kuò)散到遠(yuǎn)處器官時(shí)，5年生存率下降到11.7%，然而只有39%的患者在癌癥局限階段被檢出[2]。因此尋求更有效的早期診斷和治療方式一直是近年來結(jié)直腸癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)最早被發(fā)現(xiàn)于1976年，在這之前一直被當(dāng)作剪輯錯(cuò)誤，后被證明是生物體內(nèi)存在的廣泛多樣的內(nèi)源性非編碼RNA[3-4]。越來越多的研究表明，環(huán)狀RNA在許多疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，尤其是在結(jié)直腸癌中，與結(jié)直腸癌的分化、TNM分期及侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。篩選特異性環(huán)狀RNA可以為結(jié)直腸癌提供一個(gè)非侵入性的、敏感的診斷方式。深入研究環(huán)狀RNA與結(jié)直腸癌的關(guān)系可以為治療結(jié)直腸癌提供一個(gè)新方向。本文將結(jié)合環(huán)狀RNA的生物起源和作用機(jī)制，以及結(jié)直腸癌研究的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述，希望對未來結(jié)直腸癌的早期診斷和治療提供些許幫助。

1 環(huán)狀RNA的生物起源和生物學(xué)特性

1.1 環(huán)狀RNA的生物起源 環(huán)狀RNA最初發(fā)現(xiàn)于1976年，之后一直被科學(xué)界認(rèn)為是一種剪輯錯(cuò)誤的副產(chǎn)物[3-5]，隨著研究的深入以及二代測序技術(shù)和分子生物學(xué)的發(fā)展，大量差異表達(dá)的環(huán)狀RNA被發(fā)現(xiàn)，目前發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA總量巨大，環(huán)狀RNA的形成機(jī)制和生物功能也逐漸被揭開。環(huán)狀RNA是一類長鏈非編碼競爭性內(nèi)源RNA，它是一種無5'-3'結(jié)構(gòu)和Poly A尾的閉合共價(jià)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)[5]。閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使環(huán)狀RNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以抵抗RNA酶的降解，大多數(shù)環(huán)狀RNA的半衰期都在48 h以上，并且廣泛大量存在于組織和外周血中，為其成為潛在的分子標(biāo)志物提供了可能性[6-7]。與線性RNA的形成不同，環(huán)狀RNA主要由外顯子的反向剪輯和跳躍形成[8]。新產(chǎn)生的環(huán)狀RNA一般比線性RNAs晚，這表明大多數(shù)環(huán)狀RNA是在親本基因轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的[9]。目前關(guān)于環(huán)狀RNA形成方式主要有以下幾種：(1)套索結(jié)構(gòu)內(nèi)含子的直接環(huán)化；(2)由套索機(jī)制驅(qū)動的環(huán)化；(3)內(nèi)含子配對介導(dǎo)的環(huán)化反應(yīng)；(4)由RNA結(jié)合蛋白介導(dǎo)的環(huán)化反應(yīng)；(5)由轉(zhuǎn)運(yùn)RNA剪接驅(qū)動的環(huán)化；(6)由核糖體RNA剪接驅(qū)動的環(huán)化[7, 10]。

1.2 環(huán)狀RNA的生物學(xué)特性 環(huán)狀RNA作為最近研究的熱點(diǎn)，其獨(dú)特的生物學(xué)特性也逐漸被科研人員所認(rèn)識。主要有以下幾個(gè)特性：(1)穩(wěn)定性。與其他類型的RNA不同，環(huán)狀RNA首尾相連形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，沒有poly A尾結(jié)構(gòu)，可以抵抗核酸酶的分解，與其他類型的RNA相比，環(huán)狀RNA結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[11]。(2)保守性。環(huán)狀RNA具有序列保守性，這一特性使其在研究人員做研究時(shí)更為準(zhǔn)確[7]。(3)大量表達(dá)。環(huán)狀RNA在哺乳動物體內(nèi)大量表達(dá)，通過高通量測序目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過100萬個(gè)環(huán)狀RNA，某些環(huán)狀RNA的表達(dá)甚至比相應(yīng)的線性RNA更多，并且在很多疾病中豐度明顯增加[7, 12]。環(huán)狀RNA數(shù)量龐大，形成方式又較為多樣，雖然目前已經(jīng)成為最新的科研熱點(diǎn)并且解開了環(huán)狀RNA的部分特性和功能，但仍然需要更深入的研究去了解它的生物學(xué)特性。

2 環(huán)狀RNA的功能

2.1 作為微小RNA的分子海綿 目前研究得到的環(huán)狀RNA功能主要是微小RNA(microRNA，miRNA)的分子海綿，通過影響微小RNA的功能進(jìn)而影響相應(yīng)靶基因的表達(dá)。環(huán)狀RNA上存在大量微小RNA結(jié)合位點(diǎn)，可以與微小RNA相互結(jié)合，通過海綿吸附作用抑制微小RNA的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路以及目的基因的表達(dá)[13]。Memczak等[14]研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA可以形成一類重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，環(huán)狀RNA主要通過調(diào)節(jié)RNA及RNA結(jié)合蛋白和其結(jié)合位點(diǎn)局部游離濃度，進(jìn)而與其他RNA競爭結(jié)合微小RNA和RNA結(jié)合蛋白，成為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子。以最近研究的環(huán)狀RNA circ-ITCH為例，circ-ITCH在膀胱癌中表達(dá)下調(diào)，并且低表達(dá)的circ-ITCH與膀胱癌患者較差的生存期相關(guān)，經(jīng)驗(yàn)證circ-ITCH通過對miR-17和miR-224的分子海綿作用，上調(diào)miR-17和miR-224的靶基因p21和PTEN的表達(dá)，進(jìn)而參與相關(guān)信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)[15]。circ-ITCH在肺癌的發(fā)病中，通過分子海綿功能參與Wnt/beta-Catenin信號傳導(dǎo)通路進(jìn)而抑制肺癌的發(fā)生。其在肝癌、食管鱗狀細(xì)胞癌以及卵巢癌等眾多惡性腫瘤中也發(fā)揮相類似的分子海綿作用[16-18]。

2.2 環(huán)狀RNA的其他功能

2.2.1 蛋白質(zhì)結(jié)合功能：環(huán)狀RNA可以通過特定靶點(diǎn)與蛋白質(zhì)結(jié)合，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能。有研究表明，環(huán)狀RNA circ-Foxo3可以作為調(diào)試器調(diào)節(jié)周期蛋白依賴激酶2(CDK2)和蛋白質(zhì)p21之間的關(guān)系進(jìn)而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)[19-20]。Holdt等[21]的研究發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀RNA一個(gè)新的功能，circANRIL通過與核糖體蛋白相互作用抑制核糖體RNA的成熟。環(huán)狀RNA還可以與阿格蛋白(argunaute，AGO)結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程[14]。蛋白質(zhì)的功能多種多樣，有研究揭示環(huán)狀RNA與蛋白質(zhì)之間具有相互作用，對于未來蛋白質(zhì)領(lǐng)域的研究也具有深遠(yuǎn)影響。

2.2.2 調(diào)節(jié)基因表達(dá)功能:環(huán)狀RNA參與生物體內(nèi)遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和剪輯過程。環(huán)狀RNA可以在與普通mRNA的剪切競爭過程中影響靶基因的表達(dá)，可見環(huán)狀RNA的上調(diào)和下調(diào)可以不同程度影響其親本基因的表達(dá)[22- 23]。Petkovic等[24]的研究表明動物體內(nèi)RNA的環(huán)化與前體mRNA有競爭抑制關(guān)系，以保證組織特異性基因的表達(dá)?？梢姯h(huán)狀RNA在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中也發(fā)揮作用。

2.2.3 翻譯功能:環(huán)狀RNA攜帶遺傳信息可以行使翻譯功能。最近一項(xiàng)研究表明，乙型肝炎病毒的衛(wèi)星病毒δ病毒、HBV和HDV的包囊以一個(gè)非常規(guī)的方式共同產(chǎn)生一個(gè)122個(gè)氨基酸的病毒蛋白，這項(xiàng)研究支持在哺乳動物體內(nèi)自然產(chǎn)生的環(huán)狀RNA可以被轉(zhuǎn)錄成蛋白質(zhì)的假設(shè)[25]。研究還發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA具有編碼多肽鏈的能力[15]。這個(gè)突破性的發(fā)現(xiàn)，打破了一直以來人們對于環(huán)狀RNA從無功能的轉(zhuǎn)錄副產(chǎn)物到有功能的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的認(rèn)識，環(huán)狀RNA可能也具備核酸的翻譯特性。

隨著研究深入，越來越多的功能逐漸被科研人員認(rèn)識，對于環(huán)狀RNA的定義也逐漸得到更新。這些研究擴(kuò)展了人們的知識，從序列配對的調(diào)節(jié)器(微小RNA海綿和競爭剪輯)到結(jié)構(gòu)功能類似的蛋白質(zhì)類調(diào)節(jié)物質(zhì)，甚至到作為轉(zhuǎn)錄本翻譯蛋白質(zhì)，未來更多的環(huán)狀RNA功能將逐步被科學(xué)界解開，為疾病的早期診斷以及靶向治療提供新的探索方向。

3 結(jié)直腸癌與環(huán)狀RNA

科學(xué)界對環(huán)狀RNA研究在近20年里突飛猛進(jìn)，二代測序技術(shù)以及生物信息學(xué)的發(fā)展，越來越多的環(huán)狀RNA被發(fā)現(xiàn)于疾病相關(guān)，包括良性心血管疾病、內(nèi)分泌疾病以及惡性腫瘤等[26-27]，尤其環(huán)狀RNA與結(jié)直腸癌的關(guān)系也成為研究熱點(diǎn)。目前關(guān)于環(huán)狀RNA和結(jié)直腸癌診斷和治療的研究已經(jīng)取得一些成果。

3.1 環(huán)狀RNA在腫瘤發(fā)展和侵襲中的作用 環(huán)狀RNA在結(jié)直腸癌中有顯著的豐度變化，并且與腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后等特征密切相關(guān)。與正常對照組相比，在結(jié)腸直腸癌中，circHIPK3明顯過度表達(dá)。實(shí)驗(yàn)研究表明，circHIPK3可以通過隔離多個(gè)微小RNA來調(diào)節(jié)人體細(xì)胞的增殖[13]。Bachmayr-heyda等[28]發(fā)現(xiàn)與正常組織比較，結(jié)直腸癌細(xì)胞株和結(jié)直腸癌內(nèi)環(huán)狀RNA的豐度少，而環(huán)狀RNA的豐度與細(xì)胞增殖呈負(fù)相關(guān)。Wang等[29]的研究表明,Hsa_circ_0000567在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中均顯著下調(diào)，并且其下調(diào)與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和TNM分期均呈負(fù)相關(guān)。敲除Hsa_circ_0000567可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移。另一項(xiàng)研究表明，Hsa_circ_0014717在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)均下調(diào)，并且表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后顯著相關(guān)，過表達(dá)Hsa_circ_0014717可以顯著抑制CRC細(xì)胞增殖和集落形成，并誘導(dǎo)體外CRC細(xì)胞分化停滯在G0/G1階段，并上調(diào)細(xì)胞周期抑制蛋白P16的表達(dá)進(jìn)而參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)[30]。Ji等[31]對結(jié)直腸癌組織中環(huán)狀RNA進(jìn)行分析得出，相比較正常結(jié)直腸組織，Hsa_circ_001649在結(jié)直腸癌組織和CRC細(xì)胞系中表達(dá)顯著下調(diào)，雖然該研究顯示Hsa_circ_001649與性別、年齡、TNM分期以及CEA CA119-9和CA-724無相關(guān)性，但值得關(guān)注的是在CRC患者手術(shù)前和手術(shù)后的血清樣本中檢測到術(shù)后Hsa_circ_001649的含量顯著上調(diào)，并且與分型顯著相關(guān)。Zhuo等[32]研究中circRNA0003906在6種CRC細(xì)胞系中和122對CRC癌組織和癌旁組織進(jìn)行即時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，結(jié)果circRNA0003906的表達(dá)均下調(diào)，并且與淋巴轉(zhuǎn)移和較差的病理分型密切相關(guān)。最近的研究報(bào)道表明，circRNA的水平在KRAS突變的結(jié)腸癌細(xì)胞中顯著減少，并可被輸送到外體，這表明了circRNA可能參與了結(jié)腸直腸癌的腫瘤形成[33]。

可見環(huán)狀RNA與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有望作為結(jié)直腸癌診斷和預(yù)測預(yù)后的分子標(biāo)志物，成為結(jié)直腸癌基因治療的一個(gè)新突破。

3.2 環(huán)狀RNA參與結(jié)直腸癌內(nèi)信號傳導(dǎo)通路并影響腫瘤功能 環(huán)狀RNA可以通過參與腫瘤內(nèi)相關(guān)信號傳導(dǎo)通路影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在動物模型中，來自人類腫瘤異種移植的環(huán)狀RNA的數(shù)量與腫瘤大小有關(guān)。這些數(shù)據(jù)為研究人員提供了一種新穎獨(dú)特的方法，可以將外體環(huán)狀RNA應(yīng)用于結(jié)直腸癌的早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)后。細(xì)胞內(nèi)的環(huán)狀RNA和細(xì)胞外的環(huán)狀RNA水平相關(guān)，并且環(huán)狀RNA在細(xì)胞內(nèi)外的轉(zhuǎn)移與微小RNA相關(guān)，提示環(huán)狀RNA與其他調(diào)節(jié)物質(zhì)共同參與信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。Zhu等[34]在對3對CRC癌組織和癌旁組織的測序和分析得出，136個(gè)顯著表達(dá)和243個(gè)顯著下調(diào)的環(huán)狀RNA，并驗(yàn)證了基因BANP上5～11個(gè)外顯子產(chǎn)生的環(huán)狀RNA并命名為circular BANP。在35個(gè)CRC癌組織中，用si-circ-BANP轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞可以抑制p-Akt的表達(dá)，這為circular BANP參與PI3 K/Akt信號傳導(dǎo)通路的假設(shè)提供了證據(jù)。Xie等[35]的研究顯示hsa_circ_001569在細(xì)胞增殖和結(jié)直腸癌侵襲中發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用,hsa_circ_001569被證實(shí)是miR-145的分子海綿上調(diào)miR-145的功能靶基因E2F5、BAG4和FMNL2。在結(jié)直腸癌組織中，circ_001569與miR-145呈負(fù)相關(guān)，而miR-145與E2F5、 BAG4 和 FMNL2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。Zhang等[36]發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_103809 和 hsa_circRNA_104700在CRC組織中均顯著下調(diào)，hsa_circRNA_103809 與淋巴轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)，而hsa_circRNA_104700與遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移相關(guān)。Huang等[37]發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA Circ-ITCH在結(jié)直腸癌中表達(dá)下調(diào)，并通過參與調(diào)節(jié)Wnt/beta-catenin信號傳導(dǎo)通路而參與癌癥的調(diào)節(jié)。環(huán)狀RNA對微小RNA發(fā)揮的海綿作用，可以作為一個(gè)控制結(jié)腸癌細(xì)胞功能的手段，也就是環(huán)狀RNA在腫瘤治療方面的潛在應(yīng)用。

3.3 環(huán)狀RNA是潛在的結(jié)直腸癌靶點(diǎn) 越來越多的證據(jù)顯示了各種新型的環(huán)狀RNA和致癌基因的信號通路之間的關(guān)系，或者是對結(jié)直腸癌細(xì)胞具有侵略性和特異性的操縱，這兩者都為未來開發(fā)新藥物提供靶點(diǎn)及研究方向，以提高結(jié)直腸癌患者的早期診斷率以及存活率。已有的研究證明環(huán)狀RNA確實(shí)參與了結(jié)直腸癌疾病發(fā)生發(fā)展的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，未來還有待更深入地研究探索其具體機(jī)制并應(yīng)用于臨床。Hansen等[38]首先在小鼠大腦組織里發(fā)現(xiàn)可以吸附到miR-7上作為miR-7的分子海綿，并命名為ciRS-7。miR-7是一個(gè)目前研究較為深入的分子，是多個(gè)腫瘤相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子，通過PTEN/PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生發(fā)展[39]。另一項(xiàng)研究表明，ciRS-7下調(diào)可以抑制EGFR和IGF-1R的表達(dá)，釋放更多的miR-7，從而顯示出顯著的腫瘤抑制活性[40]。miR-7還是在結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生過程中的一個(gè)關(guān)鍵分子。ciRS-7可以綁定到miR-7的目標(biāo)序列，所以它可以充當(dāng)微小RNA的海綿抑制miR-7的功能。因此，筆者推測，對ciRS-7的下調(diào)可以增強(qiáng)miR-7的腫瘤抑制功能，從而抑制結(jié)直腸癌的發(fā)展?？傊紤]到ciRS-7在隔離miR-7和積極調(diào)節(jié)EGFR/RAF1/MAPK信號通路中的重要性，通過調(diào)節(jié)ciRS-7/miR7軸，抑制或破壞ciRS-7抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)展。未來對ciRS-7降解的治療方法的研究有望進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤抑制功能。

4 小結(jié)與展望

在過去的幾年中，人們對環(huán)狀RNA的生物合成和分子功能的研究有了很大的進(jìn)展。但是仍然還有許多未解之謎。目前幾個(gè)獨(dú)立的證據(jù)支持在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中，環(huán)狀RNA可以作為微小RNA的分子海綿發(fā)揮作用。未來關(guān)于靶基因、微小RNA和環(huán)狀RNA之間的相互作用，環(huán)狀RNA在調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制和作為分子標(biāo)志物和基因治療的原理和可行性，需要更系統(tǒng)和深入地研究和分析。確定參與結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生的眾多功能性的環(huán)狀RNA，探索它們的功能復(fù)合體和目標(biāo)位點(diǎn)，以加強(qiáng)與環(huán)狀RNA相關(guān)的結(jié)腸直腸癌的診斷和治療方案。伴隨著研究的深入以及環(huán)狀RNA研究技術(shù)的發(fā)展，環(huán)狀RNA有望成為結(jié)直腸癌早期診斷的分子標(biāo)志物和基因治療的新途徑。