摘要：小麥?zhǔn)鞘澜缰匾募Z食作物，利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究小麥對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)理，有助于整體揭示小麥干旱應(yīng)答的遺傳基礎(chǔ)。為研究干旱脅迫對(duì)小麥子粒灌漿期蛋白表達(dá)的影響，采用雙向電泳分析干旱脅迫與正常條件下成熟子粒清蛋白表達(dá)譜的差異，干旱脅迫后，小麥子粒出現(xiàn)130個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，成功鑒定出57個(gè)差異蛋白，特異表達(dá)7個(gè)，涉及ATP-葡萄糖焦磷酸化酶、過(guò)氧化還原酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑等13種蛋白質(zhì)，能量類2個(gè)，病害防御相關(guān)17個(gè)，功能未知蛋白21個(gè)。

關(guān)鍵詞：小麥;干旱脅迫;蛋白組表達(dá)

中圖分類號(hào)：S-3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191115009

我國(guó)小麥播種區(qū)大多處于干旱半干旱區(qū)，小麥基因受到激活產(chǎn)生干旱脅迫蛋白，維持個(gè)體存活，小麥抗旱品種抽穗期水分脅迫后產(chǎn)生低分子量的D-答應(yīng)蛋白，與品種的抗旱性密切相關(guān)。蛋白質(zhì)在植物細(xì)胞適應(yīng)脅迫中起到重要作用，蛋白質(zhì)作用表現(xiàn)為羥基自由基清除劑，細(xì)胞內(nèi)酶的保護(hù)劑及降低細(xì)胞內(nèi)酸度等，利用15%PEG-600高滲溶液模擬干旱脅迫條件，比較分析小麥幼苗蛋白質(zhì)含量，為小麥抗旱種質(zhì)資源篩選提供理論依據(jù)。

1 已有研究綜述

我國(guó)北方小麥生育期平均降水量不足2000mm，植物為生存不斷適應(yīng)環(huán)境，其生理反應(yīng)隨之發(fā)生系列改變，蛋白質(zhì)在小麥適應(yīng)干旱脅迫生命活動(dòng)中具有重要的作用，探究小麥蛋白含量指標(biāo)對(duì)干旱的響應(yīng)程度，對(duì)選育優(yōu)良抗旱性能的小麥具有實(shí)際意義。

干旱脅迫影響粒子碳水化合物的合成，影響小麥產(chǎn)量，春小麥生長(zhǎng)時(shí)期遭遇干旱脅迫烘烤品質(zhì)會(huì)變劣。冬小麥干旱脅迫使粒子蛋白質(zhì)含量不同程度提高，但導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)量下降。干旱促進(jìn)小麥粒子清蛋白與球蛋白在灌漿初期積累，干旱嚴(yán)重時(shí)會(huì)降低蛋白質(zhì)含量。有關(guān)干旱對(duì)小麥粒子總蛋白質(zhì)含量的研究報(bào)道較多，針對(duì)小麥粒子蛋白質(zhì)組學(xué)的研究較少[1]。

Shapiro等人在1967年發(fā)現(xiàn)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電，是生物化學(xué)領(lǐng)域廣泛使用的易于操作的測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的方法，SDS電負(fù)荷量大大超過(guò)蛋白質(zhì)分子電荷量，與其結(jié)合的多肽鏈帶均勻負(fù)電荷，所有SDS-蛋白復(fù)合體在電泳時(shí)以相同的Q/M值正向移動(dòng)，SDS-蛋白復(fù)合體在水溶液中形狀為長(zhǎng)橢圓棒，蛋白質(zhì)分子電泳遷移率主要取決于其相對(duì)分子量。

比較蛋白譜中蛋白條帶染色深淺等，得出各組小麥蛋白的差異。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的直接載體，小麥的根在不同環(huán)境中有明顯的變化，對(duì)小麥根部蛋白質(zhì)研究有重要意義。聚乙二醇是具有滲透調(diào)節(jié)功能的生物大分子，以晉麥47號(hào)為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)小麥3葉期幼苗進(jìn)行處理，使小麥根部在缺水條件下16h后，采用尿素提取蛋白，對(duì)小麥幼苗根系蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。

2 實(shí)驗(yàn)研究

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)以優(yōu)質(zhì)強(qiáng)筋小麥品種為材料，將小麥種子播種于40cm×50cm塑料盒中，播深3cm，株間距5cm，待開(kāi)花后移入人工氣候室，生長(zhǎng)溫度夜晚12℃，對(duì)照組土壤含水量為20%，干旱組土壤含水量為7%～12%，收取成熟粒子用于蛋白組學(xué)分析。

將收獲子粒磨成面粉，稱取50mg面粉放入1.5mL離心管，離心管置于冰上攪拌5min，取200μL上清液，加入1.2mL甲醇醋酸銨溶液，過(guò)夜沉淀蛋白質(zhì)。次日4℃離心10min，加入800μL預(yù)冷丙酮，清洗沉淀，離心5min，真空離心干燥40min，室溫震蕩溶解1h，吸取上清蛋白溶液，蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用Bradford法。

用500μL上樣水化液在重泡脹IPG膠條，第1向固相PH梯度等電聚焦，等電聚焦電壓參數(shù)設(shè)置150V，1.5h，500V1.0h，線性上升到800V4500Vh。聚焦結(jié)束后將膠條轉(zhuǎn)入平衡管，平衡母液配方0.05mol/L，Tris-HCl，0.3g/ml甘油。配制后分小瓶分裝，取配好的平衡母液15mL，加入乙酰胺配置成平衡液。

向SDS-PAGE垂直板電泳，用0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖封頂，膠板置于Ettan Dalt six。連接好電泳儀與控溫循環(huán)水浴進(jìn)行第2向變性膠電泳。15w/膠4h.銀染采用Plus One Silver Staining Kit方法，用固定液固定30min，用敏化液敏化30min，蒸餾水洗3遍，快速水洗膠兩面加顯色液顯色，用1.5%EDTA-Na終止反應(yīng)10min，清洗干凈的膠用掃描儀掃描，于4℃保存。

用EPSON p4990掃描儀進(jìn)行圖像掃描，蛋白點(diǎn)自動(dòng)檢測(cè)，將膠與參比膠進(jìn)行自動(dòng)匹配。手動(dòng)挖出差異蛋白點(diǎn)，將30mol/L鐵氟化鉀與100mol/L硫帶硫酸鈉1：1混合，蛋白點(diǎn)脫色完全水洗3遍終止反應(yīng)。50%乙腈清洗膠塊，真空干燥膠塊20min，加入質(zhì)譜級(jí)胰蛋白酶，4℃吸脹40min后用25mol/L碳酸氫銨覆蓋膠塊，冷凍干燥2h，-80℃待質(zhì)譜測(cè)定。

使用AB SCIEX MALDI 5800 Analyzer進(jìn)行肽指紋圖譜測(cè)定，取0.8μL酞溶液，溶于30%乙腈，混合用于質(zhì)譜分析。縫圖分析軟件為GPS Explorer TM3.6.采用Mascot軟件在NCBLnr庫(kù)中進(jìn)行匹配，選擇甲硫酸氧化作為可變與固定修飾。

2.2 結(jié)果分析

在粒子清蛋白與球蛋白雙向電泳圖譜中鑒定出蛋白點(diǎn)，第1維電泳采用24cmPH4-7的IPG膠條，通過(guò)Image Master軟件分析發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)點(diǎn)符合t檢測(cè)。

成功鑒定出的57個(gè)差異蛋白點(diǎn)，涉及13種蛋白質(zhì)，28%的蛋白點(diǎn)參與不同生化的酶，包括球蛋白、二硫鍵異構(gòu)酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑，同種蛋白酶蛋白點(diǎn)具有相同的等電點(diǎn)?？赡苡捎赗NA可變剪切引起，修飾會(huì)改變蛋白質(zhì)的分子量，可能存在多個(gè)同源基因。

干旱脅迫后上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)包括β-淀粉酶、過(guò)氧化還原酶、球蛋白、二硫鍵異構(gòu)酶、葡萄糖與核糖醇脫氫酶。干旱脅迫后下調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)有絲氨酸蛋白酶抑制劑，干旱脅迫后特異表達(dá)的蛋白質(zhì)包括真核生活轉(zhuǎn)錄起始因子5Al與球蛋白。對(duì)照表達(dá)的蛋白點(diǎn)包括果糖二磷酸縮醛酶，一些同類，能量類，疾病防御相關(guān)與轉(zhuǎn)錄。功能未知蛋白有21個(gè)，代謝類有10個(gè)，蛋白質(zhì)加工有6個(gè)，疾病預(yù)防相關(guān)有17個(gè)。

3 討論

在干旱脅迫下，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、果糖-1，與能量代謝有關(guān)的酶類會(huì)發(fā)生上調(diào)或下調(diào)表達(dá)。滿足細(xì)胞抗逆脅迫的物質(zhì)與能量需要。β-淀粉酶可水解淀粉生成麥芽糖，具有保護(hù)蛋白質(zhì)的功能。

檢測(cè)到的13個(gè)脅迫相關(guān)蛋白為絲氨酸蛋白酶抑制劑，上調(diào)表達(dá)3個(gè)，L10，L21具有相同的等電子與不同的分子量，L37，L40具有相同的分析量與不同的等電子。絲氨酸蛋白酶抑制劑在植物中含量約為3～4mg/g，普通小麥中鑒定6種不同絲氨酸蛋白酶抑制劑，絲氨酸蛋白酶抑制劑主要抑制絲氨酸蛋白酶類，普通小麥在高溫脅迫下，表現(xiàn)出絲氨酸蛋白酶抑制劑上調(diào)現(xiàn)象，在干旱脅迫下游10個(gè)下調(diào)表達(dá)的蛋白點(diǎn)鑒定為絲氨酸蛋白酶抑制劑。在多種環(huán)境下脅迫中發(fā)生差異表達(dá)。

在干旱處理中檢測(cè)到α-淀粉酶抑制劑上調(diào)表達(dá)，在硬粒小麥高溫脅迫研究中發(fā)現(xiàn)α淀粉酶抑制劑發(fā)生差異表達(dá)，α淀粉酶抑制劑在非生物逆境中作用不清楚。

Cor蛋白質(zhì)是響應(yīng)冷脅迫的蛋白質(zhì)，WCOR18編碼165氨基酸的高親水蛋白質(zhì)，研究表明WCOR18可能參與到多種脅迫應(yīng)答中，小麥在苗期干旱脅迫下超氧化物歧化酶上調(diào)表達(dá)，在粒子發(fā)育后期能增加粒子的耐脫水性，保證種子在惡劣環(huán)境條件下不萌發(fā)。

儲(chǔ)藏蛋白的變化主要是球蛋白家族，干旱中有1個(gè)特異表達(dá)的蛋白點(diǎn)鑒定為二硫鍵異構(gòu)酶，其功能是催化蛋白質(zhì)檢形成二硫鍵。二硫鍵上調(diào)表達(dá)可能為修復(fù)蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤，可能在干旱脅迫應(yīng)答中扮演重要的角色。

4 結(jié)語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)研究干旱脅迫處理對(duì)小麥根部蛋白表達(dá)的作用，發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間的干旱處理對(duì)小麥根部蛋白影響不同，實(shí)驗(yàn)中遇到很多難題，經(jīng)不斷改善實(shí)驗(yàn)操作順利完成，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要注意問(wèn)題的嚴(yán)格把控，包括離心、研磨等，處理樣品時(shí)盡量縮短時(shí)間減少步驟，實(shí)驗(yàn)采用尿素法，較直接提取法提取的蛋白量多，符合電泳樣品的標(biāo)準(zhǔn)，在蛋白提取中加1次丙酮純化蛋白，使用蛋白裂解代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法中的水，減少了誤差。制好的膠放在緩沖液中保存，使膠凝固充分，制膠與點(diǎn)樣時(shí)不能有氣泡。

作物干旱逆境條件下產(chǎn)生生理反應(yīng)為多方面，不同品種小麥在同樣干旱脅迫下，抗旱性強(qiáng)的小麥品種干旱逆境下變化較小，研究選取的品種具有較強(qiáng)的抗旱性，開(kāi)麥18幼苗蛋白質(zhì)含量變化率較大，可能幼苗蛋白表達(dá)受到影響。干旱脅迫下與對(duì)照組品種小麥幼苗蛋白質(zhì)變化顯著。金麥8號(hào)品種可作為抗旱品種利用。

參考文獻(xiàn)

[1] 盧云澤. 小麥灌漿期旗葉響應(yīng)高溫脅迫的蛋白組學(xué)與熱響應(yīng)關(guān)鍵基因HSP90的全基因組分析[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2018.

作者簡(jiǎn)介：

白建瑞（1978-），女，本科，講師。研究方向：生物學(xué)。