王玉鵬，鮑 婕

(武警安徽省總隊(duì)醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥 230041)

結(jié)核病是由結(jié)核桿菌導(dǎo)致的、經(jīng)呼吸道傳染的威脅人類健康的一種重要傳染病。盡管近年來已經(jīng)有較為有效的治療方法及藥物，但結(jié)核病的發(fā)病率依然呈逐年升高的趨勢(shì)。我國(guó)是僅次于印度的第二大結(jié)核病發(fā)病國(guó)，并且是耐藥性結(jié)核病流行最嚴(yán)重的國(guó)家之一[1-2]。

抗結(jié)核病治療的一線用藥為異煙肼、利福平、鏈霉素、吡嗪酰胺和乙胺丁醇。其中，異煙肼(isoniazid,INH)通過抑制結(jié)核桿菌細(xì)胞所特有的分枝菌酸合成，使得結(jié)核桿菌失去疏水性、耐酸性和增殖能力而導(dǎo)致死亡，是一線抗結(jié)核藥物中不可替代的首選藥物。但抗結(jié)核病藥物治療中，最常見的不良反應(yīng)是肝損傷[3-5]，一系列文獻(xiàn)報(bào)道異煙肼具有肝臟毒性[6]，臨床資料提示異煙肼的應(yīng)用可以引起20%左右的患者出現(xiàn)肝功能改變，約1.6%的患者可發(fā)展為癥狀性肝炎使抗結(jié)核病的治療中斷，更有較少數(shù)患者可引起肝功能衰竭甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的肝損傷而導(dǎo)致死亡，但異煙肼的肝毒性機(jī)制至今仍未闡明。筆者對(duì)現(xiàn)階段潛在的異煙肼肝毒性機(jī)制研究進(jìn)行綜述，為防治抗結(jié)核藥物誘導(dǎo)的肝損傷提供新思路。

1 異煙肼代謝物與肝毒性

異煙肼是一種容易被氧化的酰肼類化合物，其代謝產(chǎn)物乙酰肼(acetylhydrazine)和肼(hydrazine)被普遍認(rèn)為與異煙肼肝毒性有關(guān)[7]，這些毒性代謝產(chǎn)物可在大鼠肝細(xì)胞中誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)的過度產(chǎn)生。其中N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2(N-acetyltransferase 2 ,NAT2)和CYP2E1是異煙肼代謝為乙酰肼和肼的代謝關(guān)鍵酶。

1.1 乙酰肼

早期有文獻(xiàn)[8]表明，大鼠異煙肼單純治療組未表現(xiàn)出肝毒性，乙酰肼與苯巴比妥合用則可造成急性肝損傷。從代謝層面上看，異煙肼可被NAT2代謝為乙酰異煙肼后水解成乙酰肼，乙酰肼經(jīng)由CYP2E1的催化，氧化形成N-羥基乙酰肼，其可進(jìn)一步脫水形成乙酰二嗪，乙酰二嗪作為一種毒性代謝產(chǎn)物，可裂解為活性離子，共價(jià)結(jié)合肝臟中的大分子，從而造成肝損傷[9-10]。

1.2 肼

肼具有肝、腎、中樞神經(jīng)等多器官毒性，是致癌、致突變的肝毒性物質(zhì)[11]。肼可產(chǎn)生氧自由基和超氧化物，破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)而造成多肽鏈降解[12]，有研究發(fā)現(xiàn)異煙肼治療中超氧化物含量增加[13]。Garrod等[14]對(duì)SD大鼠給予肼，采用NMR技術(shù)評(píng)估了肼對(duì)肝臟的生化影響。通過組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞產(chǎn)生低毒至中毒的改變。肝臟中的三酰甘油和β-丙氨酸含量升高，而肝糖原、膽堿、葡萄糖、牛黃酸和三甲胺-N-氧化物含量降低，牛黃酸和β-丙氨酸相協(xié)同的變化被視為肝毒性的標(biāo)志。Bando等[15]運(yùn)用基于 GC-MS的代謝組學(xué)方法開展肼誘導(dǎo)肝損傷的毒性評(píng)估，結(jié)果顯示肼誘導(dǎo)肝損傷大鼠的血液、尿液中谷胱甘肽前體和代謝產(chǎn)物的含量均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。谷胱甘肽的耗竭已被證實(shí)可以誘發(fā)肝細(xì)胞的凋亡[16]。

2 線粒體功能障礙

近年來國(guó)內(nèi)外研究表明，線粒體損傷是各類肝損傷，諸如肝功能衰竭、脂肪肝、肝硬化等病癥的重要發(fā)病機(jī)制之一。線粒體是真核細(xì)胞能量供應(yīng)和新陳代謝的主要場(chǎng)所，線粒體損傷會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞能量耗竭，誘發(fā)凋亡和壞死[17-18]。使用動(dòng)物細(xì)胞系進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，異煙肼的肝毒性伴隨著線粒體膜電位變化和DNA鏈斷裂[19]。張煒等[20]體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示異煙肼給藥降低小鼠肝細(xì)胞線粒體中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶的活性，增加丙二醛(malondialdehyde，MDA)及mtDNA中8-OH脫氧鳥苷的含量，出現(xiàn)線粒體腫脹、基質(zhì)疏松、嵴斷裂、膜不完整甚至完全消失，空泡或內(nèi)容物生成，表現(xiàn)出線粒體損傷。Bhadauria S等[21-22]證實(shí)異煙肼可在人肝癌細(xì)胞株HepG2中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，造成線粒體損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡。異煙肼及其毒性代謝產(chǎn)物肼通過產(chǎn)生氧化應(yīng)激，抑制線粒體呼吸鏈中間酶活性，干擾細(xì)胞能量代謝，對(duì)線粒體膜發(fā)起攻擊導(dǎo)致其功能異常，最終引起線粒體損傷，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序[23]。

3 氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是指細(xì)胞內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，被認(rèn)為是肝臟毒性最主要的機(jī)制之一[24]。臨床數(shù)據(jù)顯示，接受異煙肼治療的患者血漿中谷胱甘肽水平增加，MDA含量減少，說明異煙肼可造成氧化應(yīng)激[25]。異煙肼引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)與ROS和RNS的產(chǎn)生有關(guān)，ROS可以造成細(xì)胞內(nèi)的基本復(fù)合體分子(如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA)發(fā)生退化，引起線粒體損傷，致DNA變異，脂質(zhì)過氧化，細(xì)胞因子生成增加，甚至細(xì)胞凋亡[26]。

CYP2E1是細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵酶，CYP2E1的誘導(dǎo)是發(fā)生氧化應(yīng)激、產(chǎn)生ROS、造成肝損傷的中心環(huán)節(jié)[27]。異煙肼可在小鼠[28]、大鼠[29]體內(nèi)誘導(dǎo)CYP2E1的蛋白表達(dá)。有研究表明[30]，慢乙?；吆蛿y帶CYP2E1 c1/c1基因型的患者較其他患者在抗結(jié)核藥物誘導(dǎo)的肝損傷中具有更高的患病風(fēng)險(xiǎn)。

核因子E2相關(guān)因子2-抗氧化反應(yīng)元件信號(hào)通路(nuclear factor-E2-related factor 2-antioxi-dant response elements,Nrf2-ARE)是細(xì)胞內(nèi)主要的氧化應(yīng)激防御機(jī)制。Chen等[31]證實(shí)異煙肼是有效的抗氧化反應(yīng)元件活性抑制劑，在3T3-L1細(xì)胞,HepG2細(xì)胞株中，它可以有效抑制許多抗氧化反應(yīng)元件依賴性抗氧化劑和Ⅱ相解毒酶的活性，此研究表明異煙肼造成的肝損傷的機(jī)制有可能是由于抑制抗氧化反應(yīng)元件依賴性抗氧化劑的表達(dá)而導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。

4 脂質(zhì)過氧化

內(nèi)源性的脂質(zhì)過氧化(lipid peroxidation)被認(rèn)為是異煙肼產(chǎn)生細(xì)胞毒性的主要原因之一。異煙肼及其代謝產(chǎn)物生成高濃度的ROS，ROS是脂質(zhì)過氧化的刺激物，造成細(xì)胞膜損傷，所以異煙肼作為脂質(zhì)過氧化的刺激物造成細(xì)胞凋亡和肝臟壞死。同時(shí)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生具有毒性的醛副產(chǎn)物，引起一系列下游效應(yīng)，如破壞細(xì)胞膜完整性、線粒體和肌質(zhì)網(wǎng)功能異常、鈣穩(wěn)態(tài)失衡等。

MDA是脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物，是評(píng)價(jià)脂質(zhì)過氧化的主要參數(shù)，SOD是體內(nèi)唯一一個(gè)可以清除超氧陰離子的酶，對(duì)機(jī)體氧化與抗氧化作用平衡起到不可忽視的重要作用。谷胱甘肽的體內(nèi)含量是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要因素。文獻(xiàn)報(bào)道[24,34-36]，異煙肼治療組MDA含量升高、SOD活性降低，谷胱甘肽含量下降較對(duì)照組差異明顯，大鼠肝臟損傷嚴(yán)重程度與脂質(zhì)過氧化程度呈明顯相關(guān)性。

5 異煙肼肝毒性的新理論

除了上面提及的異煙肼肝毒性機(jī)制的幾種常見假說，一些新的機(jī)制理論被業(yè)界廣泛認(rèn)同。

5.1 原卟啉是造成異煙肼肝毒性的關(guān)鍵物質(zhì)

Li等[37]使用孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)-人源性小鼠模型揭示：異煙肼與利福平合用在肝中經(jīng)由PXR介導(dǎo)的亞鐵血紅素生物合成途徑造成原卟啉IX(protoporphyrin IX)積聚，原卟啉IX是血紅素生物合成的中間體，同時(shí)原卟啉IX也是一種內(nèi)源性的肝毒性物質(zhì)，大劑量的原卟啉IX具有一定的肝毒性，可以在肝臟中蓄積導(dǎo)致膽汁栓塞型肝損傷[38]。PXR的激活可以上調(diào)氨基乙酰丙酸合成酶(aminolevulinic acid synthase，ALAS1)的表達(dá)，在體內(nèi)以甘氨酸和琥珀酰輔酶A為原料，經(jīng)ALAS1催化生成產(chǎn)物氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid ,ALA)。氨基乙酰丙酸是原卟啉IX的前體物質(zhì)，進(jìn)入線粒體膜生成原卟啉IX[39]。高濃度的原卟啉IX在異煙肼、利福平合用的PXR-人源性小鼠肝臟中被檢測(cè)出。PXR-ALAS1是異煙肼、利福平造成肝損傷的一條關(guān)鍵性通路，通過PXR信號(hào)通路的激活，造成ALAS1上調(diào)和細(xì)胞色素P450酶基因的激活，增加亞鐵血紅素在肝臟中的生物合成和原卟啉IX的積聚，原卟啉IX在肝臟中蓄積導(dǎo)致肝損傷[40]。這一結(jié)果為異煙肼和利福平誘導(dǎo)的肝損傷機(jī)制提供了一個(gè)新思路。Sachar等[41]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，異煙肼通過上調(diào)ALAS1水平和下調(diào)亞鐵螯合酶(ferrochelatase，F(xiàn)ECH)水平，通過抑制FECH的活性，使原卟啉 IX轉(zhuǎn)化為血紅素的能力下降，導(dǎo)致原卟啉 IX 在細(xì)胞中積聚，誘導(dǎo)形成肝損傷。

5.2 免疫系統(tǒng)的相互作用

有證據(jù)表明，肝損傷是由適應(yīng)性免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的[42-43]。異煙肼可以誘發(fā)一種類似狼瘡的綜合征，表明它可以引起免疫反應(yīng)[44-45]。事實(shí)上，異煙肼可以與體外的巨噬細(xì)胞結(jié)合，表明藥物可以通過與巨噬細(xì)胞上的醛基結(jié)合并刺激白細(xì)胞介素-6的產(chǎn)生，從而形成共價(jià)加合物并啟動(dòng)免疫反應(yīng)[46]。

5.3 細(xì)胞色素P450酶作用

細(xì)胞色素P450(cytochrome P450 ,CYPs)酶是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的蛋白酶，目前己知的CYPs的種類超過1000多種，人肝臟中CYP 3A4的含量最豐富，約占CYPs總量的40%，并參與50%以上常用藥物種類的代謝。有研究發(fā)現(xiàn)，CYP3A4可能參與異煙肼的代謝、生物活化，同時(shí)與異煙肼肝損傷的形成有關(guān)。Vignati等[47]發(fā)現(xiàn)將異煙肼與CYP3A4重組基因酶系共同孵育培養(yǎng)，細(xì)胞存活率顯著降低，呈現(xiàn)出細(xì)胞毒性，在給予CYP3A4抑制劑后，這一現(xiàn)象出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。在臨床實(shí)驗(yàn)中，在異煙肼誘導(dǎo)的肝損傷患者體內(nèi)檢出抗-CYP3A4抗體[46]，說明異煙肼誘導(dǎo)的肝損傷與CYP3A4有緊密聯(lián)系。張志華[48]應(yīng)用QSG-7701肝細(xì)胞株進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用異煙肼處理后，細(xì)胞CYP3A4活性顯著升高，異煙肼和利福平合用時(shí)則使其活性進(jìn)一步升高，表明異煙肼可作為CYP3A4誘導(dǎo)劑，異煙肼和利福平合用時(shí)產(chǎn)生協(xié)同作用，推測(cè)這種作用是其合用對(duì)肝細(xì)胞毒性增加的機(jī)制之一。 相反，有報(bào)道認(rèn)為異煙肼抑制CYP3A4的活性[49]。另有報(bào)道指出，未發(fā)現(xiàn)CYP3A4在小鼠體內(nèi)參與異煙肼生物活化和造成肝毒性的依據(jù)[50]。說明CYP3A4在異煙肼誘導(dǎo)的肝臟毒性中產(chǎn)生的作用存在爭(zhēng)議，有待進(jìn)一步的研究論證。

6 結(jié)論與展望

目前的研究中，對(duì)異煙肼的肝毒性機(jī)制的討論主要集中于：異煙肼代謝產(chǎn)物乙酰肼和肼具有肝毒性；異煙肼可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，致線粒體損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡；異煙肼及其代謝產(chǎn)物作為脂質(zhì)過氧化的刺激物會(huì)造成細(xì)胞凋亡和肝臟壞死。同時(shí)，一些新的機(jī)制理論也被研究者發(fā)現(xiàn)。但是，當(dāng)前異煙肼致肝損傷的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，尚存在爭(zhēng)議?？菇Y(jié)核藥物的肝損傷副作用是患者中斷抗結(jié)核病化療的重要原因之一，所以異煙肼等抗結(jié)核藥物的肝毒性機(jī)制亟待研究透徹，需要科研人員進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，為臨床使用抗結(jié)核藥物減少肝損傷不良反應(yīng)，提供理論基礎(chǔ)。

為預(yù)防和規(guī)避異煙肼等抗結(jié)核病藥物的肝損傷不良反應(yīng)，還需加強(qiáng)以下幾方面的研究：第一，目前，預(yù)測(cè)和診斷抗結(jié)核病藥物引起肝損傷的生物標(biāo)志物仍以傳統(tǒng)肝功能指標(biāo)為主，如血清丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)[51]，但這些生物標(biāo)志物存在早期預(yù)測(cè)差，特異性較低等不足[52]。因此，應(yīng)加快尋找預(yù)測(cè)和診斷抗結(jié)核病藥物誘導(dǎo)的肝損傷的特異性生物標(biāo)志物，高特異性、高靈敏度的生物標(biāo)志物有利于早期預(yù)測(cè)并規(guī)避抗結(jié)核藥物引發(fā)的肝損傷不良反應(yīng)，推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。第二，進(jìn)一步加強(qiáng)藥物濃度、患者基因型與肝損傷發(fā)生程度關(guān)系的相關(guān)研究，在臨床使用中，對(duì)易誘發(fā)肝損傷的高?；蛐徒Y(jié)核病患者可考慮抗結(jié)核病化學(xué)治療方案的調(diào)整。第三，早期研究發(fā)現(xiàn)水飛薊素對(duì)于抗結(jié)核藥物誘發(fā)的肝損傷有較好的治療效果[53]，現(xiàn)已用于臨床。更多的類似化合物被發(fā)現(xiàn)，文獻(xiàn)報(bào)道玉郎傘多糖、咖啡酸多巴胺等化合物可以有效對(duì)抗抗結(jié)核病藥物的肝毒性，具有一定的肝臟保護(hù)作用[54,36]。這種類似化合物對(duì)抗結(jié)核病藥物肝毒性的預(yù)防和保護(hù)作用研究，需要進(jìn)一步深入研究其安全性和有效性。