邢佳鑫 陳 玲 張 希 張敦宇 李維蛟③

(1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院 云南昆明650201;2云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室云南昆明650205;3云南中醫(yī)藥大學(xué) 云南昆明650500)

白芨（Bletilla striata）是蘭科多年生草本地生植物，生長(zhǎng)在海拔100～3 200 m的常綠闊葉林下，櫟樹林、路邊草或巖石縫中，是珍貴的藥用植物，具有收斂止血、清熱解毒、抗菌、抗腫瘤、消腫生肌的功能。白芨膠可作為天然高分子藥物成膜材料、助懸劑和天然的藥物乳化劑［1-4］。近年來，市場(chǎng)對(duì)白芨的需求量在不斷上升，但白芨種子在自然狀況下很難萌發(fā)和生長(zhǎng)，因此白芨組培苗成為當(dāng)前人工栽培的主要種苗來源［5］。由于近年來正品藥材短缺難以滿足市場(chǎng)需求，民間常用其他類似品種取而代之，代用品、習(xí)用品的隨意使用使得中藥材品種復(fù)雜混亂的情勢(shì)加劇。隨著白芨組織培養(yǎng)及育苗技術(shù)的發(fā)展，白芨的偽品也越來越多，因此白芨組培苗的真?zhèn)舞b定逐漸成為市場(chǎng)需求的重要技術(shù)。

蘇鈦等發(fā)現(xiàn)，滇產(chǎn)白芨、小白芨、黃花白芨在植物形態(tài)、藥材性狀、顯微特征方面都高度相似，在分類學(xué)上特征差異亦較?。?］；陳美君等［7］對(duì)白芨和黃花白芨的化學(xué)成分進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)白芨和黃花白芨所含化學(xué)成分也很相似，難以鑒別。因此利用感官評(píng)價(jià)、顯微鑒定和理化鑒定等中藥鑒定技術(shù)［8］難以鑒別出真正的白芨苗。近些年來，分子標(biāo)記技術(shù)在藥用植物鑒別研究中已有廣泛應(yīng)用，具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、快速、微量，不受生長(zhǎng)發(fā)育階段、器官組織差異、環(huán)境條件影響等優(yōu)勢(shì)，它給現(xiàn)代藥用植物的鑒別研究注入了新的活力，開辟了新的道路，雖尚處于資料積累階段，但可預(yù)見其具有巨大的應(yīng)用潛力，可推動(dòng)中藥材的現(xiàn)代化研究進(jìn)程［9-10］?！吨袊?guó)藥典》2010年版已將蘄蛇和烏梢蛇的分子鑒定作為評(píng)價(jià)指標(biāo)［11］。其中SSR和ISSR具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，具有操作簡(jiǎn)單、多態(tài)性豐富、重復(fù)性強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性好、模板用量少和試驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，不僅可用于不同產(chǎn)地藥用植物資源的劃分，同樣也可用于物種的鑒定與劃分，為育種工作奠定基礎(chǔ)。Safaei等［12-14］利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)6個(gè)丹參種的39個(gè)植物樣本進(jìn)行研究，結(jié)果表明該技術(shù)能應(yīng)用于形態(tài)學(xué)研究中的物種鑒定與劃分。

本研究通過選用SSR引物和ISSR引物，應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)外觀較相似的白芨組培苗與正品紫花白芨組培苗樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析，成功構(gòu)建了利用SSR和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)快速鑒定白芨組培苗真?zhèn)蔚姆椒ā?/p>

1 材料與方法

1.1 材料

白芨樣品：1份正品紫花白芨組培苗，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培育，編號(hào)為1號(hào)；7份外觀較相似的白芨組培苗，于市場(chǎng)上購(gòu)買得到，分別編為2～8號(hào)。

1.2 方法

1.2.1 白芨DNA的提取

采用改進(jìn)的CTAB法［15］提取白芨的基因組DNA，即取約0.1 g樣品葉片，放入2 mL EP管內(nèi)，再放入經(jīng)酒精消毒過的直徑為5 mm的小鋼珠，寫好編號(hào)，放在方形的EP管盒內(nèi)，向盒內(nèi)倒入液氮，速凍葉片，倒出液氮，蓋上盒蓋，上下快速震蕩，使小鋼珠充分研磨葉片；加入400 μL含有2%（V/V）β-疏基乙醇的CTAB緩沖液，溫和混勻；65℃溫浴30～60 min，每隔一段時(shí)間振動(dòng)一次離心管，使其充分混勻，受熱均勻；用等體積（400 μL）的氯仿/異戊醇（24∶1）抽提勻漿液，顛倒數(shù)次使其充分混勻，于18℃10 000 r/min離心10 min，吸取上清液到另一無菌的1.5 mL EP管中，加入等體積-20℃預(yù)冷30 min的異丙醇，顛倒混勻，-20℃靜置1 h；1 h后，于4℃ 10 000 r/min離心10 min沉淀DNA；棄上清液，加入適量（1 mL）75%乙醇洗滌沉淀，10 000 r/min，4℃，離心5 min；棄洗滌液，加入適量（1 mL）75%乙醇再次洗滌沉淀，10 000 r/min，4℃，離心5 min；于4℃ 10 000 r/min離心5 min，棄上清液，待DNA干燥后，用1×TE溶解，并用RNA酶除去RNA?？侱NA采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量，并用紫外分光光度計(jì)（Thermo Nano-Drop 2 000）檢測(cè)DNA濃度，然后稀釋至25 ng/μL用于SSR-PCR和ISSR-PCR反應(yīng)。

1.2.2 SSR-PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系共20 μL，其中DNA模板（25ng/μL）2 μL，2×Mix（天根生物科技）10 μL，正反引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH2O 6μL。PCR反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀（Biometro）上按以下程序運(yùn)行，首先94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min，4℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物以MakerDL 1 000為分子量標(biāo)準(zhǔn)，取7 μL PCR產(chǎn)物用含GenGreen核酸染料的4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像儀（Platinum HD7）下觀察拍照。

1.2.3 ISSR-PCR擴(kuò)增

PCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括DNA模板（25ng/μL）2 μL，2×Mix（天根生物科技）10 μL，正反引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀（Biometro）上按以下程序運(yùn)行，首先94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物以MakerDL1 000為分子量標(biāo)準(zhǔn)，取7 μL PCR產(chǎn)物用含GenGreen核酸染料的3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在紫外分光透射儀（Platinum HD7）下觀察拍照。

1.2.4 引物合成

選用黎君等篩選出的20對(duì)白芨SSR引物（表1）［16］，和22對(duì)ISSR隨機(jī)引物（表2），由上海生工公司合成。用20對(duì)SSR引物分別擴(kuò)增1號(hào)正品白芨DNA，篩選出多態(tài)性豐富、主帶明顯的引物。

表1 SSR引物信息

表2 ISSR引物信息

1.2.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

用MakerDL 1 000作為分子量的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)各擴(kuò)增片段的遷移距離和大小，將SSR和ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果中穩(wěn)定出現(xiàn)的條帶的有或無分別進(jìn)行賦值，在相同遷移位置，有帶記為1，無帶記為0，以“0，1”格式構(gòu)成SSR和ISSR帶型數(shù)據(jù)矩陣。利用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA質(zhì)量檢測(cè)

1份正品紫花白芨和7份組培苗的基因組DNA，在1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1。所提取的DNA整齊，電泳條帶清晰，未被蛋白質(zhì)污染，也無降解，基因組DNA純度較高。所提DNA的質(zhì)量能滿足后續(xù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)。用紫外分光光度計(jì)在260和280 nm處測(cè)量吸光度A，進(jìn)行DNA純度、濃度計(jì)算。將所提DNA的濃度全部稀釋為25 ng/μL，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

圖1 8份材料的DNA電泳圖

2.2 引物篩選

20對(duì)SSR引物擴(kuò)增1號(hào)正品白芨DNA的電泳檢測(cè)結(jié)果見圖2。從中篩選出重復(fù)性好，多態(tài)性豐富，條帶清晰的14對(duì)SSR引物，分別為Bjssr01、Bjssr03、 Bjssr04、 Bjssr05、 Bjssr06、Bjssr09、 Bjssr11、 Bjssr13、 Bjssr14、Bjssr17、 Bjssr19、 Bjssr22、 Bjssr23、Bjssr24。

圖2 SSR引物篩選結(jié)果

2.3 樣品差異性分析

部分SSR引物和部分ISSR引物對(duì)供試樣品的擴(kuò)增結(jié)果分別見圖3。14對(duì)SSR引物中，發(fā)現(xiàn)有7對(duì)檢測(cè)出部分供試樣品之間帶型存在差異（表3）。22對(duì)ISSR引物中，發(fā)現(xiàn)有21對(duì)檢測(cè)出部分供試樣品之間帶型存在差異（表4）。其中，Bjssr03、Bjssr17和uBC808檢測(cè)出4號(hào)和8號(hào)樣品與1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品之間存在帶型差異；Bjssr05、Bjssr011檢測(cè)出4、5、6號(hào)和7號(hào)樣品與1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品之間存在帶型差異。Bjssr04、Bjssr14、Bjssr22、uBC811、uBC814、uBC815、uBC817、uBC818、uBC820和uBC823檢測(cè)出4、5、6、7號(hào)和8號(hào)樣品與1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品之間存在帶型差異。

綜上所述，篩選出的36對(duì)引物都未檢測(cè)出2號(hào)和3號(hào)與1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品之間存在帶型差異。根據(jù)不同的引物擴(kuò)增結(jié)果，4、5、6、7號(hào)和8號(hào)樣品與1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品之間存在帶型差異。表明2號(hào)和3號(hào)為真的紫花白芨可能性較大，4、5、6、7號(hào)和8號(hào)為假的紫花白芨。

3 討論

本研究采用了分子標(biāo)記技術(shù)，從基因?qū)用鎭龛b定白芨組培苗的真實(shí)性，解決了白芨真?zhèn)舞b定困難的問題，建立了更加精準(zhǔn)，快捷的白芨鑒定的技術(shù)方法。共篩選出14對(duì)SSR引物和22對(duì)ISSR引物，其擴(kuò)增結(jié)果多態(tài)性位點(diǎn)豐富，條帶清晰可見，結(jié)果穩(wěn)定，這些標(biāo)記可作為白芨分子鑒定的依據(jù)。

近年來，SSR技術(shù)已成功應(yīng)用于作物品種的真?zhèn)舞b定方面，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于道地藥材的品質(zhì)鑒定。楊雙等［17］應(yīng)用SSR技術(shù)建立了玉米品種沈玉21的DNA指紋圖譜，成功鑒定了兩份樣品的真?zhèn)危稽S成志等［18］利用SSR分子標(biāo)記成功鑒定了水稻種子中優(yōu)88、協(xié)優(yōu)88和全豐優(yōu)88的真?zhèn)魏图兌龋Y(jié)果表明SSR分子標(biāo)記鑒定和田間鑒定的結(jié)果基本上一致；周曄等［19］運(yùn)用顯微鑒定和ISSR技術(shù)鑒別中藥玉竹（Polygonatum odoratum）及其摻偽品小玉竹（P.humile），結(jié)果顯示通過ISSR標(biāo)記可以將玉竹及其主要摻偽品區(qū)分開，同時(shí)，運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)能有效的區(qū)分中藥黃精 （P.sibiricum） 和卷葉黃精 （P.cirrhifolium）［20］，保證了用 藥 的安全；羅沛宜［21］通過篩選ISSR引物，找到了特異性的當(dāng)歸條帶，能成功的對(duì)當(dāng)歸及其混偽品進(jìn)行鑒別。然而，利用分子標(biāo)記技術(shù)來鑒定白芨的真?zhèn)芜€未見報(bào)道。因此，本研究中建立的白芨分子鑒定體系具有重要的實(shí)用意義，為以后的白芨組培苗的分子鑒定提供了依據(jù)，可為白芨屬植物資源的保護(hù)、利用和評(píng)價(jià)奠定良好基礎(chǔ)。

圖3 部分SSR引物（I）和部分ISSR引物（II）對(duì)8份材料的擴(kuò)增電泳圖

表3 7對(duì)SSR引物的帶型數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

表4 8對(duì)ISSR引物的帶型數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在利用分子標(biāo)記進(jìn)行真?zhèn)舞b定時(shí)，分子標(biāo)記要盡量多選，標(biāo)記少的話，可能會(huì)鑒定不出樣品的差異，從而導(dǎo)致結(jié)果錯(cuò)誤，把假的誤認(rèn)為真的，本研究中用到的分子標(biāo)記數(shù)量較多，為試驗(yàn)結(jié)果的可信度提供了保證。