汪曉丹,趙金雪,張 明,翁文佳,高艷青*

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院皮膚科,北京 100069;2北京市房山區(qū)第一醫(yī)院皮膚科;*通訊作者,E-mail:gyqing2001bj@sina.com)

隨著HIV/AIDS的流行及其他危險(xiǎn)因素的增多,如靜脈吸毒、男男性接觸(men who have sex with men,MSM),梅毒合并HIV的感染率越來越高。梅毒以細(xì)胞免疫為主,而HIV可以破壞機(jī)體的細(xì)胞免疫。人們推測兩種疾病或許有較廣泛的相互作用,如早期的一些研究顯示,梅毒會導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)下降、HIV載量升高[1],進(jìn)而推測,合并梅毒可能會加快HIV感染進(jìn)展為AIDS。研究發(fā)現(xiàn)異常的CD8+T細(xì)胞免疫活化水平與AIDS進(jìn)展較為密切[2]。本研究嘗試從外周血CD8細(xì)胞活化與凋亡,初步探索梅毒對于HIV感染的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象

研究對象均來自2009-2014年首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院性病艾滋病診療中心隨訪的MSM隊(duì)列人群。其中26例早期梅毒患組(包括一期、二期梅毒、早期潛伏梅毒,且不伴HIV感染),18例HIV感染組(外周血CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)≥350個(gè)/μl,感染HIV時(shí)間>6個(gè)月),18例早期梅毒合并HIV感染組(外周血CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)≥350個(gè)/μl,感染HIV時(shí)間>6個(gè)月)。收集病例過程中不包括年齡小于18歲、孕婦或合并有活動性肺結(jié)核的患者。所有梅毒患者均未進(jìn)行驅(qū)梅治療,所有HIV感染者均未進(jìn)行高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(highly active antiretro-viral therapy,HAART)治療。選擇MSM隊(duì)列中性別和年齡相匹配的未暴露于HIV和梅毒的20例健康者作為對照。一般情況見表1。

表1 四組患者的基線資料

Table 1 Baseline data of the patients

組別n年齡(歲)梅毒分期(例)基線RPR一期梅毒二期梅毒早期潛伏梅毒≤1∶41∶8-1∶32>1∶32CD4計(jì)數(shù)HIV載量 健康組2036(24-53)-------- 早期梅毒組2631(24-42)481411132-- HIV組1829(19-44)------436(359-530)30920(1294-1157417)合并組1833(20-48)35103132410(351-623)45621(460-266000)

表中的數(shù)據(jù)為中位數(shù)(范圍),“-”為未檢測

1.2 方法

1.2.1 Ficoll-Hypaque密度離心法分離PBMC 健康對照組采集新鮮血。取新鮮采集的EDTA抗凝全血離心(TGL-16G臺式離心機(jī),北京六一儀器廠)去除血漿后,用PBS稀釋一倍,加至淋巴細(xì)胞分離液上層,2 500 r/min,離心25 min,取中間白膜層(即單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞富集層),PBS洗滌2遍,得到PBMC。早期梅毒組、HIV感染組、早期梅毒合并HIV感染組均為凍存PBMC,于42 ℃恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司),快速晃動凍存管,使凍存的細(xì)胞在1 min內(nèi)解凍。

1.2.2 熒光抗體染色 PBMC自液氮中取出復(fù)蘇后,加入熒光染色抗體表面染色:CD3 PerCP CD8a APC,CD38 PE,HLA-Dr FITC,細(xì)胞內(nèi)染色:caspase-3 PE。室溫孵育20 min,PBS洗滌2次后,用2%多聚甲醛重懸細(xì)胞,上機(jī)檢測。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測 染色后的所有樣品均在FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)上檢測,并采用Flowjo7.6.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以前向散射角(FSC)和側(cè)向散射角(SSC)圈定淋巴細(xì)胞,再以CD3、CD4、CD8圈定CD8+T細(xì)胞。活化水平由CD38+HLA-DR+CD8+T細(xì)胞的比例來表示。凋亡水平由capease-3比例來表示。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有原始數(shù)據(jù)核對后采用SPSS 22.0軟件(SPSS Inc,Chicago,Illinois)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料結(jié)果以中位數(shù)表示。組間比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。多組間的比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組間CD8細(xì)胞活化的比較

采用流式細(xì)胞技術(shù)分析了HIV感染組、早期梅毒組、早期梅毒合并HIV組及健康人外周血中CD8活化標(biāo)記CD38與HLA-DR的陽性率,結(jié)果表明,HIV組與合并組CD38陽性率明顯高于健康組(9.44%±0.90%,9.87%±0.99%vs5.97%±0.66%,P<0.05)。早期梅毒組與其他組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;HLA-DR陽性率在四組間比較,HIV組與合并組HLA-DR陽性率明顯高于健康組(23.11%±1.90%,21.72%±2.15%vs4.35%±0.74%,P<0.05)。早期梅毒組與其他組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1)。

2.2 四組間CD8細(xì)胞凋亡的比較

采用流式細(xì)胞技術(shù)分析了HIV感染組、早期梅毒組、早期梅毒合并HIV組及健康組外周血中CD8凋亡標(biāo)記caspase-3的陽性率,結(jié)果顯示合并組顯著高于HIV組(13.09%±2.37%vs8.21%±3.29%,P<0.05);合并組與梅毒組(1.81%±0.97%)、健康組(0.24%±0.17%)相比較,caspase-3陽性率也顯著升高(P<0.001);HIV組顯著高于健康組(P<0.05,見圖2)。

2.3 單純梅毒不同分期caspase-3的比較

采用流式細(xì)胞技術(shù)分析了單純梅毒不同分期與健康人血漿caspase-3,結(jié)果顯示,二期梅毒組明顯高于健康組(17.91%±2.99%vs7.25%±5.65%,P<0.05,見圖3)。

與健康組比較,*P<0.05

與健康組比較，*P<0.05,***P<0.001；與合并組比較，#P<0.05,###P<0.001

與健康組比較,*P<0.05

3 討論

梅毒免疫反應(yīng)極其復(fù)雜,病理生理研究表明,梅毒不僅僅是由毒性或炎癥物質(zhì)釋放造成的簡單急性炎癥反應(yīng),梅毒皮損中占主導(dǎo)地位的是單核巨噬細(xì)胞,而非急性炎癥的多核白細(xì)胞。目前認(rèn)為梅毒的免疫是一種遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng),效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子在梅毒螺旋體的清除過程中起重要作用。HIV作為一種免疫缺陷病毒,可引起細(xì)胞免疫嚴(yán)重受損,推測HIV感染或許可以改變機(jī)體針對梅毒螺旋體的感染免疫。處于免疫缺陷狀態(tài)時(shí),梅毒可能會加速進(jìn)展,甚至出現(xiàn)所謂的“惡性梅毒”[3-6]。本研究從外周血CD8細(xì)胞活化與凋亡方面入手,初步探索梅毒對于HIV感染的影響。

艾滋病的免疫病理改變特征主要包括:CD4細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行性減少、功能逐漸受損以及免疫系統(tǒng)的異常激活。CD8細(xì)胞在病毒的清除中起重要作用。CD38是一種胞外酶,與T細(xì)胞共刺激信號的傳遞及細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān),CD38通過轉(zhuǎn)導(dǎo)激活信號,促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的激活。HLA-DR是主要組織相容性復(fù)合物-Ⅱ類分子,主要表達(dá)在激活的T淋巴細(xì)胞上。以CD38和HLA-DR表達(dá)水平為指標(biāo)的免疫激活與HIV感染進(jìn)展具有很好的相關(guān)性[2,7,8]。李太生等[9]研究發(fā)現(xiàn),與正常組相比,HIV組和AIDS組的T淋巴細(xì)胞各激活亞群的百分比均顯著升高,CD38+CD8+亞群的百分比與CD4計(jì)數(shù)和病毒載量相關(guān)性最為密切。

有研究證實(shí)梅毒的皮損中含有豐富的CD8細(xì)胞[10]。關(guān)于活化標(biāo)志HLA-DR在梅毒的研究也多數(shù)集中在局部組織。McBroom等[11]分析了6例不伴HIV的二期梅毒和5例合并HIV的二期梅毒患者,對其皮損取樣,進(jìn)行免疫組化分析,發(fā)現(xiàn)不論HIV感染狀態(tài)如何,皮損組織中的炎性細(xì)胞均廣泛表達(dá)HLA-DR,推測這些活化的炎性細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子創(chuàng)造局部炎性環(huán)境。章松平等[12]分析HIV患者以及HIV/AIDS合并早期隱性梅毒患者的CD3+HLA-DR+,發(fā)現(xiàn)單純HIV感染,CD3+HLA-DR+比例升高,并隨病程進(jìn)展這種升高愈加明顯,而HIV合并早期隱性梅毒患者CD3+HLA-DR+亦升高,但隨病情進(jìn)展,CD3+HLA-DR+沒出現(xiàn)明顯的變化,推測隨著梅毒螺旋體感染的進(jìn)一步發(fā)展,臨床上出現(xiàn)了相應(yīng)癥狀,導(dǎo)致CD4細(xì)胞數(shù)目顯著降低,T淋巴細(xì)胞的激活程度再次加強(qiáng),加速了病情的惡化。本研究發(fā)現(xiàn)HIV組和合并組CD38、HLA-DR的陽性率明顯高于健康組,合并組與單純HIV感染組并無差異,提示在梅毒合并HIV感染中,機(jī)體的免疫系統(tǒng)異?；罨砸訦IV感染為主導(dǎo),合并梅毒感染并未促進(jìn)CD8細(xì)胞的活化。

細(xì)胞凋亡對于正常機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)是非常重要的,受感染細(xì)胞死亡,有利于病毒的清除[13]。Caspase是一種天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶,目前發(fā)現(xiàn)人源Caspase家族共有11種,根據(jù)Caspase原域長短,可將其分為起始組、炎癥組和效應(yīng)組[14],在HIV-1有效感染細(xì)胞內(nèi),病毒可以在T細(xì)胞中復(fù)制,完成融合,逆轉(zhuǎn)錄,整合,轉(zhuǎn)錄,翻譯等全部過程,激活caspase-3,引起細(xì)胞凋亡。目前關(guān)于凋亡與梅毒螺旋體感染的研究不多,Fan等[15]研究顯示,二期梅毒患者外周血淋巴細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞凋亡比例升高,且這種凋亡與Fas途徑以及Bcl-2的低表達(dá)相關(guān)。Luo等[16]體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)caspase-3活性與梅毒螺旋體膜蛋白Tp92蛋白濃度相關(guān),證實(shí)Tp92通過RIPK1/caspase-8/caspase-3通路介導(dǎo)THP-1細(xì)胞的凋亡。

我們研究發(fā)現(xiàn)單純HIV組和合并組caspase-3高于健康人,合并組高于HIV組,推測梅毒感染在一定程度上促進(jìn)了HIV感染者CD8細(xì)胞的凋亡。我們進(jìn)一步分析了單純梅毒不同分期與健康人caspase-3,結(jié)果顯示二期梅毒患者明顯高于健康組。由于合并組較單純HIV感染組CD8活化指標(biāo)并無顯著變化,而凋亡指標(biāo)顯著增高。推測合并梅毒螺旋體感染可以在一定程度上加劇HIV感染者CD8細(xì)胞的凋亡,而這部分凋亡不僅僅是CD8活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(activation-induced cell death,AICD)所致。這與趙建斌等[17]研究結(jié)論一致。但由于本研究例數(shù)相對較少,所以我們的假設(shè)還有待更大樣本量研究的進(jìn)一步證實(shí)。