秋水仙素誘導(dǎo)百合黃精靈多倍體研究

吳青青1， 胡小京， 崔 嵬1， 楊 瀾1， 石樂(lè)娟1， 許紅娟1， 班甜甜1， 夏景烽

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/貴州省園藝工程技術(shù)研究中心， 貴陽(yáng) 550009； 2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 貴陽(yáng) 550025)

百合(Lilium)是百合科百合屬多年生球根草本植物，花大，花色艷麗，花姿優(yōu)美，是切花、盆花和園林布局的優(yōu)良材料[1-2]。OT百合品種黃精靈(Yelloween)是東方百合與喇叭百合遠(yuǎn)緣雜交得到的品種，為二倍體植株，其花黃色，株型美觀，花朵直立向上開(kāi)放，生長(zhǎng)迅速，抗病性強(qiáng)，有很高的觀賞價(jià)值。同時(shí)，由于多倍體植株具有器官加大、花期延長(zhǎng)、莖干加粗、抗逆性增強(qiáng)等特點(diǎn)，如果利用多倍體誘導(dǎo)技術(shù)對(duì)黃精靈進(jìn)行加倍，充分利用多倍體植株的生理優(yōu)勢(shì)，則很可能得到更加優(yōu)秀的新品種。

目前，多倍體育種也在國(guó)內(nèi)百合新品種培育方面得到大量應(yīng)用，自黃濟(jì)明[9]首先進(jìn)行百合多倍體誘導(dǎo)后，劉選明[10]、何林[11]等也做了大量工作，培育了許多優(yōu)秀的百合多倍體品種。秋水仙素可以阻止紡錘體的形成，是一種高效的多倍體誘導(dǎo)劑，國(guó)內(nèi)外都在大量應(yīng)用。

黃精靈是優(yōu)良種質(zhì)資源，是通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交得到的品種。其生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，雜種優(yōu)勢(shì)明顯，但是表現(xiàn)為高度不育，難以應(yīng)用到雜交育種中。主要原因是其染色體同源性差，在減數(shù)分裂聯(lián)會(huì)時(shí)難以成功，造成配子發(fā)育失敗。誘導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交種的多倍體可以有效改善染色體同源性差的問(wèn)題，因?yàn)檫@等同于為每條染色體都增加了一條同源染色體，是使用這些種質(zhì)雜交育種的有效手段[3-8,13]。

流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometer, FCM)是20世紀(jì)80年代興起的新技術(shù)，可以快速、大量地進(jìn)行細(xì)胞層面的檢測(cè)，通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)核酸含量的測(cè)量，可以準(zhǔn)確的判斷植物的倍性。不同于傳統(tǒng)的根尖生長(zhǎng)點(diǎn)染色體觀察，流式細(xì)胞儀對(duì)大量的細(xì)胞核進(jìn)行統(tǒng)計(jì)性觀測(cè)，獲得的數(shù)據(jù)具有廣泛性特征，避免了取樣造成的誤差，結(jié)果準(zhǔn)確可靠[12]。

本試驗(yàn)嘗試使用秋水仙素誘導(dǎo)來(lái)獲得黃精靈的加倍植株，通過(guò)流式細(xì)胞儀來(lái)篩選出多倍體，并作為進(jìn)一步雜交育種的材料。

另外，試驗(yàn)中所使用的培養(yǎng)基配方為多年來(lái)繁育自育東方百合品種貴陽(yáng)紅所使用配方，將其應(yīng)用于OT百合黃精靈的多倍體誘導(dǎo)組織培養(yǎng)中，也是為了驗(yàn)證這個(gè)配方的通用性與有效性。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為百合黃精靈的鱗片，剝?nèi)∽再F州省園藝研究所組培室的黃精靈組培苗，挑選生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的較大鱗莖采集。

1.2 方 法

1.2.1秋水仙素的配制

使用濃度為A:0.05%、B:0.075%、C:0.1%、D:0.125%、E:0.15%、F:0.175%、G:0.2%的秋水仙素溶液作為誘導(dǎo)劑，配制好的秋水仙素溶液貼好標(biāo)簽，121 ℃滅菌后待用。

1.2.2多倍體的誘導(dǎo)

取黃精靈組培苗鱗片，使用上述不同濃度的秋水仙素分別處理12、24、36、48、60、72 h，每個(gè)組合處理20個(gè)鱗片。處理完后的鱗片用無(wú)菌水清洗3次，每次浸泡10 min。接種到MS+蔗糖60 g·L-1+瓊脂粉5 g·L-1+活性炭0.5 g·L-1+6-BA 0.3 mg·L-1，pH值5.8的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

1.2.3流式細(xì)胞儀鑒定多倍體

取從誘導(dǎo)鱗莖的底部分生出的小鱗莖幼嫩葉片3～4 mm，加裂解液200μL，用鋒利的刀片快速切碎，加入1.5 mL的DAPI(4’6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽)暗染2～4 min，用30μm的濾網(wǎng)過(guò)濾到3 mL的玻璃管，流式細(xì)胞儀測(cè)定倍性。由于流式細(xì)胞儀主要使用葉片檢測(cè)，因此主要針對(duì)于長(zhǎng)出葉片的小鱗莖進(jìn)行倍性檢測(cè)。計(jì)算變異率時(shí)忽略處理死亡的鱗片，變異標(biāo)準(zhǔn)為能夠在檢測(cè)結(jié)果圖像中看到明顯的區(qū)別于二倍體的峰。

誘變率(%)=(變異鱗莖數(shù)/檢測(cè)鱗莖數(shù))×100%。

1.2.4多倍體根尖染色體觀察

取變異的百合植株根尖1～2 cm，用0.7 mmol·L-1的放線菌酮室溫處理4 h后，卡諾氏液(無(wú)水乙醇∶冰醋酸=3∶1)固定12 h以上備用，可較長(zhǎng)時(shí)間保存。根尖進(jìn)行觀察前，先用0.5 mol·L-1的鹽酸解離20 min，再用清水浸泡40 min，切取處理好的根尖分生區(qū)1～2 mm乳白色部分于載玻片上，滴1～2滴卡寶品紅染色液染色12 min左右，蓋上蓋玻片后，橡皮擦敲擊使根尖細(xì)胞散開(kāi)，顯微鏡觀察其染色體。

圖1 百合鱗片褐化

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素誘導(dǎo)對(duì)材料的影響

培養(yǎng)30 d后，部分鱗片開(kāi)始出現(xiàn)褐化死亡；50 d時(shí)，每個(gè)處理均有鱗片褐化死亡。死亡率最小的是0.05%處理12 h，僅有2個(gè)鱗片死亡，死亡率為10%，0.2%處理72 h的鱗片全部死亡。

由表1可知，在同一個(gè)處理時(shí)間，隨秋水仙素處理濃度的增加，死亡率總體呈升高趨勢(shì)。以12 h處理為例，從A濃度至G濃度，死亡率從10%上升至65%，雖然在F濃度略有下降，但是并沒(méi)有改變總體上升的趨勢(shì)。24、36、48、60 h處理總體與12 h處理相似，死亡率隨著濃度的升高有明顯的差異。

表1 秋水仙素誘導(dǎo)對(duì)百合鱗片的影響

秋水仙素濃度處理時(shí)間/h處理鱗片數(shù)/個(gè)死亡數(shù)/個(gè)死亡率/%A1220210B1220735C1220840D12201260E12201260F12201050G12201365A2420735B24201155C2420840D24201155E24201155F24201365G24201785A3620945B36201680C36201155D3620840E36201260F36201470G36201470A48201155B48201050C4820945D48201260E48201260F4820945G48201680A6020945B60201050C6020840D60201260E60201470F60201365G60201995A72201470B72201470C7220945D72201470E72201575F72201575G722020100

在相同處理濃度的情況下，不同的處理時(shí)間死亡率不同。以濃度A為例，從12 h至72 h的時(shí)間長(zhǎng)度梯度處理中，死亡率逐漸由10%上升至70%，死亡率隨著處理時(shí)間的加長(zhǎng)呈明顯的上升趨勢(shì)，B、D、E、F、G與A相似。

綜合來(lái)看，秋水仙素對(duì)植物的毒害作用隨著處理濃度和處理時(shí)間的增加而加強(qiáng)，在G濃度72 h處理中死亡率達(dá)100%。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)植株倍性

在超凈工作臺(tái)中采集新生小鱗莖的葉片使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其倍性。用二倍體黃精靈作為對(duì)照，取其葉片經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定，結(jié)果如圖2所示，按照流式細(xì)胞儀設(shè)計(jì)原理，四倍體黃精靈的信號(hào)峰應(yīng)該出現(xiàn)在二倍體峰右側(cè)，四倍體峰的x軸坐標(biāo)值應(yīng)等于二倍體峰x軸坐標(biāo)值的2倍。

圖2 黃精靈二倍體流式細(xì)胞儀圖像

首先取濃度A處理12 h至72 h的所有材料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示基本全部為二倍體，只有24 h的處理中出現(xiàn)了一個(gè)嵌合體，從四倍體峰的高度來(lái)判斷，應(yīng)該是秋水仙素起到了一定誘導(dǎo)效果(見(jiàn)圖3)。檢測(cè)結(jié)果表明，0.05%濃度的秋水仙素誘導(dǎo)效果較差。

依次對(duì)各個(gè)濃度的處理進(jìn)行檢測(cè)，0.075%的誘導(dǎo)效果和0.05%的誘導(dǎo)效果差異不大，在四倍體的位置雖有少量信號(hào)存在，數(shù)量很少，基本可以忽略(圖4)。

0.1%濃度的秋水仙素處理效果較好，在24 h之后的處理時(shí)間上都得到了不錯(cuò)的誘導(dǎo)率，但得到的植株都是嵌合體。如圖5所示，被檢測(cè)植株是明顯的二倍體與四倍體的嵌合體，有大量的二倍體細(xì)胞和四倍體細(xì)胞同時(shí)存在，這種情況在秋水仙素誘導(dǎo)百合鱗片產(chǎn)生多倍體中經(jīng)常發(fā)生。另一方面，區(qū)別于根尖染色體數(shù)目觀察的低采樣率，流式細(xì)胞儀可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)成千上萬(wàn)的大量細(xì)胞核進(jìn)行核酸含量的檢測(cè)，能夠分辨每個(gè)植物細(xì)胞的倍性水平并從統(tǒng)計(jì)的角度反映植株整體的倍性分布狀況，是一種高效而準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

圖3 0.05%處理24 h流式細(xì)胞儀圖像

圖4 0.075%處理72 h流式細(xì)胞儀圖像

濃度0.1%至0.2%的誘導(dǎo)效果都較好，容易得到變異植株，這些植株基本都是嵌合體，唯獨(dú)在0.2%處理24 h中得到了1株較為純凈的四倍體，如圖6所示。

從表2可見(jiàn)，秋水仙素的濃度對(duì)于誘導(dǎo)產(chǎn)生變異植株的概率有較大的影響，在較低濃度0.05%和0.075%水平上，雖然處理了較長(zhǎng)時(shí)間，并沒(méi)有得到很好的誘導(dǎo)效果。濃度從0.1%開(kāi)始，取得了較好的誘導(dǎo)效果，其中0.1%處理48 h和0.125%處理60 h這2個(gè)組合都有較高的誘導(dǎo)率，分別為56%、55%。不過(guò)，也并不是處理濃度越高變異率就越高，0.1%、0.125%、0.15%3個(gè)濃度總體上誘導(dǎo)效果要優(yōu)于0.175%和0.2%，但差異不大，2個(gè)最高的誘導(dǎo)率也出現(xiàn)在0.1%、0.125%濃度中。

表2 不同秋水仙素濃度與不同處理時(shí)間對(duì)黃精靈的誘變效果

秋水仙素濃度/%處理時(shí)間/h檢測(cè)新生鱗莖數(shù)/個(gè)變異數(shù)/個(gè)變異率/%12140024101103611000.05486006050072400 12123252461173673430.1254884506011655725240121000247000.075366004880060600727001282252462333663500.15487343606233725120128002483293672170.148955660822572734312102202472293661170.17548113276072297251201252402431330.23662334821506010072000

從處理時(shí)間來(lái)看，也并不是時(shí)間越長(zhǎng)，變異率就越高，綜合來(lái)看，36 h和48 h在不同濃度上都有較好的誘導(dǎo)效果。

獲得四倍體以嵌合體居多，這些嵌合體很可能在生長(zhǎng)中逐漸恢復(fù)為二倍體，這在多倍體誘導(dǎo)中經(jīng)常發(fā)生。試驗(yàn)中，只有0.2%處理24 h組合得到了1株較為純凈的四倍體。由于獲得的純凈四倍體較少，很難說(shuō)明這是否與濃度有相關(guān)性，或者只是單純的概率問(wèn)題，這點(diǎn)還需深入研究。

圖5 0.1%處理24 h檢測(cè)圖像

圖6 四倍體圖像

2.3 變異植株染色體的觀察

對(duì)檢測(cè)出的四倍體植株根尖進(jìn)行壓片觀察，發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)正常二倍體染色體數(shù)2 n=2 x=24(圖8 a)，詳細(xì)辨認(rèn)后發(fā)現(xiàn)，四倍體細(xì)胞染色體數(shù)為2 n=4 x=48(圖8 b)。

3 討 論

試驗(yàn)中，雖然秋水仙素處理過(guò)的鱗片被清洗3次才轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但清洗浸泡時(shí)間有限，鱗片很難將秋水仙素完全排出，其后的培養(yǎng)過(guò)程中，這些鱗片不斷地向培養(yǎng)基中排出劇毒的秋水仙素，這很可能影響了新生鱗莖的生長(zhǎng)，造成部分小鱗莖生長(zhǎng)勢(shì)弱乃至死亡，以此推測(cè)，經(jīng)常更換培養(yǎng)基可以有效提高新生鱗莖的生長(zhǎng)，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，試驗(yàn)驗(yàn)證了培養(yǎng)基配方的有效性，所使用培養(yǎng)基配方為試驗(yàn)室用于東方百合組培快繁的專用配方，基本滿足了試驗(yàn)材料的生長(zhǎng)及不定芽的增殖，取得了較好的效果，但是依然有進(jìn)一步優(yōu)化的余地。

圖7 處理鱗片新生小鱗莖

圖8 百合根尖染色體數(shù)

百合作為花卉用于商品生產(chǎn)已經(jīng)有100多年的歷史，此前主要的育種工作由美國(guó)和荷蘭完成，他們通過(guò)野生種的雜交選育，逐漸形成了當(dāng)下8個(gè)商業(yè)品種雜交系的格局。以黃精靈為例，其由東方百合與喇叭百合雜交得到，這屬于親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的遠(yuǎn)緣雜交，這種遠(yuǎn)緣雜交策略被大量重復(fù)應(yīng)用，形成了新的OT雜交系，歸于8個(gè)雜交系中的“其他類型(Miscellaneoushybrids)”。目前，通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交獲得新品種的做法已經(jīng)在百合育種領(lǐng)域成為主流，最新出現(xiàn)的LO、LA兩個(gè)雜交系既是利用麝香百合分別與東方百合、亞洲百合雜交獲得的，通過(guò)這些工作，誕生了大量遠(yuǎn)緣雜交新品種，為進(jìn)一步的育種工作提供了新的種質(zhì)資源，在使用這些新品種進(jìn)行雜交育種方面，多倍體誘導(dǎo)技術(shù)擁有廣泛的應(yīng)用前景，對(duì)于克服其不育性與受精前障礙都有很大的幫助。