張國(guó)躍　王莉芳　劉越　喬蓉霞　王夢(mèng)琪

[摘要]目的 建立用硫化氫熏蒸白芍的操作方法和檢測(cè)方法。方法 分別用硫磺、硫化氫熏蒸白芍藥材和飲片，采用高效液相色譜法測(cè)定用不同熏蒸方法后白芍中的芍藥苷、芍藥苷亞硫酸酯、沒食子酸的含量變化。結(jié)果 芍藥苷進(jìn)樣量為0.055 08～1.652 40 mg、沒食子酸進(jìn)樣量為0.011 52～0.345 60 mg，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程分別為y=1E+06x-201 93，r=0.999和y=1E+06x+975.7，r=0.999，回收率分別為99.73%和97.85%。用硫化氫熏蒸后，白芍藥材中主要成分未發(fā)生明顯變化，硫磺熏蒸后的白芍飲片，芍藥苷含量都有不同程度的下降，同時(shí)出現(xiàn)了白芍中原本沒有的芍藥苷亞硫酸酯，硫化氫熏蒸后的白芍飲片，芍藥苷和沒食子酸含量與熏蒸前比較，變化不大;熏蒸前24個(gè)批次樣品二氧化硫殘留量的均值為47.7 mg/kg，采用硫化氫熏蒸后的二氧化硫殘留量均值為50.4 mg/kg，變化不大，采用硫磺熏蒸后的二氧化硫殘留量均值為225.0 mg/kg，變化明顯。結(jié)論 用硫化氫替代硫磺熏蒸白芍效果較好，方法基本可行，含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性較好。

[關(guān)鍵詞]硫化氫;硫磺;熏蒸;芍藥苷;沒食子酸;芍藥苷亞硫酸酯;高效液相色譜法

[中圖分類號(hào)] R284? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）10（c）-0015-05

[Abstract] Objective To establish the operation method and detection method of fumigating Radix Paeoniae Rubra with hydrogen sulfide. Methods The contents of paeoniflorin， paeoniflorin sulfite and gallic acid in Radix Paeoniae Rubra after fumigation with sulfur and hydrogen sulfide were determined by high performance liquid chromatography. Results The injection amount of paeoniflorin was 0.055 08-1.652 40 mg， and the injection amount of gallic acid was 0.011 52-0.345 60 mg， showed a good linear relationship with the peak area， the regression equations were y=1E+06x-201 93， r=0.999 and y=1E+06x+975.7， r=0.999， respectively， the recovery rates were 99.73% and 97.85%. After fumigation with hydrogen sulfide， the main components of Radix Paeoniae Rubra did not change significantly， after sulfur fumigation， the content of paeoniflorin in decoction pieces of Radix Paeoniae Rubra decreased in varying degrees， at the same time， there was paeoniflorin sulfite in Paeonia lactiflora， which was not originally found in Radix Paeoniae Rubra. Compared with the content of paeoniflorin and gallic acid before fumigation， the content of paeoniflorin and gallic acid in the pieces of paeony after fumigation with hydrogen sulfide had little change. The average sulfur dioxide residue of 24 batches of samples before fumigation was 47.7 mg/kg， and the average sulfur dioxide residue after fumigation with hydrogen sulfide was 50.4 mg/kg， with little change. The average sulfur dioxide residue after fumigation with sulfur was 225.0 mg/kg， with obvious change. Conclusion The effect of fumigating Paeonia lactiflora with hydrogen sulfide instead of sulfur is better. The method is basically feasible. The content determination method is simple， the result is accurate and the reproducibility is good.

[Key words] Hydrogen sulfide; Sulfur; Fumigation; Paeoniflorin; Gallic acid; Paeoniflorin sulfite; High performance liquid chromatography

中藥材用硫磺來(lái)熏制自古有之，硫磺熏蒸藥材具有漂白、干燥、殺菌、防霉、殺蟲的作用，但過(guò)度及濫用硫磺熏蒸，會(huì)引起中藥材亞硫酸鹽的殘留，還會(huì)導(dǎo)致藥效成分發(fā)生改變，給藥材的安全性和有效性帶來(lái)較大的風(fēng)險(xiǎn)及隱患。本研究首次提出將硫化氫運(yùn)用于中藥材熏蒸，選擇常用硫磺熏蒸且已導(dǎo)致不良后果的白芍為研究對(duì)象[1-2]，比較不同熏蒸方法對(duì)白芍化學(xué)成分、硫元素殘留的影響，研究結(jié)果顯示，用硫化氫熏蒸后的白芍，二氧化硫的殘留量和芍藥苷、沒食子酸等活性成分均無(wú)明顯變化，同樣能起到漂白、干燥、防霉、殺蟲的作用，可為白芍的前期處理提供一種安全有效的方法。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)儀器

島津LG-2040-3D型高效液相色譜儀（二極管陣列檢測(cè)器，日本島津公司）、Agilent 1260型高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司），Waters empower工作站（美國(guó)Waters公司）;色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料（Agilent公司，5 μm，4.6 mm×250 mm）、（phenomenex公司，5 μm，4.6 mm×250 mm）;SartoriusBS224S電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）;STEHDB-107-1智能一體化二氧化硫殘留量測(cè)定儀（濟(jì)南盛泰電子科技有限公司）;UPH-11-10T型超純水器（四川超純科技有限公司）。

1.2試樣與試劑

1.2.1試樣? 白芍藥材均自購(gòu)，標(biāo)注產(chǎn)地分別是山東、黑龍江、山西、安徽、浙江、江蘇、河南共10批（自編號(hào)：藥材1～10）;白芍飲片來(lái)源于省級(jí)監(jiān)督抽驗(yàn)，共有14個(gè)批次，生產(chǎn)企業(yè)分別來(lái)自陜西的西安、咸陽(yáng)、寶雞、商洛和安徽亳州、湖北十堰以及河北的中藥飲片生產(chǎn)企業(yè)（自編號(hào)：飲片1～14）。

1.2.2對(duì)照物質(zhì)和試劑? 芍藥苷（批號(hào)：110736-201842）、沒食子酸（批號(hào)：110831-200302）對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供;芍藥苷硫酸亞酯由本實(shí)驗(yàn)室制備。鹽酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180104）、硫化亞鐵（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：201701019）均為分析純，升華硫（上海國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)：20160101）為化學(xué)純。甲醇（SIGMA-ALDRICH公司，批號(hào)：WXBC9153V）、乙腈（SIGMA-ALDRICH公司，批號(hào)：WXBC82165V）均為色譜純，試驗(yàn)用水為純化水和超純水。

1.3方法

在實(shí)驗(yàn)室條件下，分別用硫磺、硫化氫熏蒸白芍飲片（硫化氫為本實(shí)驗(yàn)室自制），考察兩種藥劑熏蒸前后性狀、精密度與穩(wěn)定性、線性、重復(fù)性、回收率、化學(xué)成分的變化及二氧化硫殘留量的變化。

1.3.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)? Agilent色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%磷酸溶液;柱溫30℃，測(cè)定波長(zhǎng)230 nm，流速1.0 ml/min，梯度洗脫：時(shí)間0→10→25→40→50→60 min，流動(dòng)相A：2%→8%→15%→17%→20%→45%。

1.3.2對(duì)照品溶液的配制? 精密稱取芍藥苷、沒食子酸、芍藥苷亞硫酸酯對(duì)照品適量，分別加甲醇制成含芍藥苷約50 μg/ml、沒食子酸和芍藥苷亞硫酸酯各10 μg/ml的溶液。

1.3.3樣品溶液的制備? 分別取硫磺、硫化氫熏蒸前后的白芍飲片樣品粉末約0.1 g，精密稱取，加50%甲醇25 ml，稱取重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱取重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)即得。

1.3.4精密度與穩(wěn)定性考察? 取上述對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10 μl，重復(fù)測(cè)定6次。

1.3.5線性考察? 取芍藥苷對(duì)照品溶液（濃度為55.08 μg/ml）、沒食子酸對(duì)照品溶液（濃度為11.52 μg/ml），按上述1.3.1的色譜條件，分別進(jìn)樣1、2、5、10、20、30 μl，以進(jìn)樣量（x）作為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值（y）作為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

1.3.6重復(fù)性考察? 取6份同一樣品（飲片1），照上述1.3.3的方法制備試樣，然后測(cè)定。

1.3.7回收率考察? 精密稱取樣品粉末（飲片1，芍藥苷含量為3.01%、沒食子酸含量為0.32%）各0.05 g共6份，精密加入含有芍藥苷和沒食子酸對(duì)照品的混合溶液（濃度分別為1.50 mg/L和0.16 mg/L）1 ml，揮干，按照上述1.3.3的方法制備供試樣，測(cè)定芍藥苷和沒食子酸的回收率。

1.3.8硫磺、硫化氫熏蒸前后白芍化學(xué)成分的變化? 根據(jù)1.3.1的色譜條件，采用高效液相色譜（HPLC）法檢測(cè)。

1.3.9硫磺、硫化氫熏蒸后二氧化硫殘留量的變化? 按照《中國(guó)藥典》（2015年版四部通則2331第一法）收載的方法[3]，對(duì)收集到的白芍藥材及飲片逐批測(cè)定二氧化硫殘留量，首先取樣品5～10 g，精密稱取，置圓底燒瓶中，采用蒸餾儀器裝置蒸餾，收集餾出液，用氫氧化鈉滴定液滴定，規(guī)定二氧化硫殘留量≤400 mg/kg。

2結(jié)果

2.1熏蒸前后性狀變化

未熏蒸的樣品呈微粉紅色，表面略具粉性，味微酸，用硫磺熏蒸后，樣品表面逐漸變白，熏制10 h以上時(shí)，有明顯的酸腐氣味，較刺鼻，用硫化氫熏蒸后，樣品也逐漸變白，熏蒸10 h后，略有酸味，二者有明顯差異。

2.2硫磺、硫化氫熏蒸后精密度與穩(wěn)定性考察

芍藥苷、沒食子酸對(duì)照品峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.96%和1.44%;取制得的樣品溶液分別在0、2、4、6、12、23 h測(cè)定，峰面積的RSD分別為1.12%和1.66%。

2.3線性關(guān)系考察

回歸方程分別為y=1E+06x-201 93，r=0.999和y=1E+06x+975.7，r=0.999，芍藥苷進(jìn)樣量在0.055 08～1.652 40 mg，沒食子酸進(jìn)樣量在0.011 52～0.345 60 mg，與峰面積呈良好的線性關(guān)系（圖1）。

2.4重復(fù)性考察

芍藥苷的平均含量為3.01%，RSD=0.92%;沒食子酸的平均含量為0.32%，RSD=1.43%，重復(fù)性良好。

2.5回收率考察

芍藥苷的平均回收率為99.73%，RDS=0.59;沒食子酸的平均回收率為97.85%，RSD=1.95%（表1、2）。

2.6硫磺、硫化氫熏蒸前后白芍化學(xué)成分的變化

硫磺熏蒸后的白芍飲片，芍藥苷含量都有不同程度的下降，同時(shí)出現(xiàn)了白芍中原本沒有的芍藥苷亞硫酸酯，硫化氫熏蒸后的白芍飲片，芍藥苷和沒食子酸含量與熏蒸前比較，變化不大（表3、圖2）。

2.7白芍藥材和飲片二氧化硫殘留量的測(cè)定

熏蒸前24個(gè)批次樣品二氧化硫殘留量的均值為47.7 mg/kg，采用硫化氫熏蒸后的二氧化硫殘留量均值為50.4 mg/kg，變化不大;采用硫磺熏蒸后的二氧化硫殘留量均值為225.0 mg/kg，變化明顯（表4）。

3討論

硫磺熏蒸藥材可殺蟲防霉，為傳統(tǒng)的藥材養(yǎng)護(hù)方法，也曾在《中國(guó)藥典》[3]中收載過(guò)。由于逐漸認(rèn)識(shí)到硫磺熏蒸藥材后殘留二氧化硫，《中國(guó)藥典》（2005年版）以后取消了所有藥材的硫熏工藝，但在實(shí)際應(yīng)用中，硫磺熏蒸從來(lái)就沒有真正停止過(guò)[4-8]。中藥材經(jīng)過(guò)硫磺熏蒸后，會(huì)生成二氧化硫，二氧化硫作為一種還原劑，與中藥材中的某些化學(xué)成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使中藥材中的主要有效成分含量下降，同時(shí)會(huì)使某些化學(xué)成分增加或有新物質(zhì)生成。研究顯示[9-10]，白芍中的芍藥苷含量在硫磺熏蒸后明顯下降，同時(shí)產(chǎn)生了藥材中原本沒有的化學(xué)成分芍藥苷亞硫酸酯，本研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。資料顯示[11-17]，白芍為常用的藥材，硫磺熏蒸對(duì)其外觀性狀、活性成分甚至含有白芍藥味中藥制劑的影響多有研究，總體上看，負(fù)面情況較多。

本研究結(jié)果顯示，硫磺熏蒸后的白芍飲片，芍藥苷含量都有不同程度的下降，同時(shí)出現(xiàn)了白芍中原本沒有的芍藥苷亞硫酸酯，該衍生物的安全性尚不得知;硫化氫熏蒸后的白芍飲片，芍藥苷和沒食子酸含量與熏蒸前比較，變化不大。

本研究采用硫化亞鐵和稀鹽酸反應(yīng)來(lái)制備硫化氫，反應(yīng)原理為FeS+2HCl=FeCl2+H2S↑，將收集到的硫化氫氣體導(dǎo)入裝有樣品的密閉容器中，放置一定時(shí)間后，進(jìn)行測(cè)定。此方法只適合在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，若要應(yīng)用于大量的藥材處理時(shí)，需進(jìn)一步研究熏蒸操作方法。

本研究采用硫磺熏蒸藥材及飲片時(shí)，盡量采用藥農(nóng)的熏蒸方式，但因?qū)嶒?yàn)室條件的限制，熏蒸的效果會(huì)和藥農(nóng)熏蒸有差異，主要是熏蒸強(qiáng)度很難達(dá)到，因此與日常監(jiān)督檢驗(yàn)檢測(cè)到的熏蒸藥材中二氧化硫殘留量比較，數(shù)值較低。同時(shí)采用不同的熏蒸時(shí)間作比較，用硫磺熏蒸白芍時(shí)，熏蒸時(shí)間越長(zhǎng)，二氧化硫殘留量越高，芍藥苷的含量越低，芍藥苷亞硫酸酯的含量從無(wú)到有逐漸增加，與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)相符合[18-19]，改用硫化氫熏蒸后，延長(zhǎng)熏蒸時(shí)間，二氧化硫殘留量基本上沒有變化。

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（收稿日期：2019-05-24? 本文編輯：劉克明）