陳 頔

(黑龍江省林業(yè)科學院，哈爾濱 150081)

試驗是在東北林業(yè)大學校園內進行，5月初，試驗采用小葉楊、小青楊、小黑楊楊樹扦插苗，栽于塑料花盆(上口直徑28 cm，下底直徑22 cm，高25 cm)中，每盆1株，按株行距0.5 m×0.5 m擺放，恢復生長1個月。

試驗中采用黑色尼龍網(wǎng)搭設遮陰棚控制光照強度，分為3個光照強度，相對光強分別相當于全光照下的25%和50%，光照強度采用TES-1335型數(shù)字照度計進行測定，分別以Ⅰ、Ⅱ表示，以100%自然光照為對照(即不遮陰)，表示為Ⅲ。在苗木栽植中，氮肥的施肥量在0.2～2 kg，按照試驗栽培密度，設置氮肥的施肥量的3個水平分別為：20 g/株，60 g/株，分別以N1、N2來表示兩個施肥量的處理，以不施肥為對照，表示為N0。在試驗期間，氮肥(與水的比例為1∶200)分2次施入，施肥時間定為6月初和7月初，每天要保證土壤的水分充足。分別于6月30日、7月30日采集采集長勢相近的楊樹健康葉片，每個處理3個重復，每個重復5株。新鮮葉片充分混勻，并置于夾鏈袋內，低溫密封保存帶回實驗室，-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1 儀器與藥品

儀器：電子天平、臺式冷凍離心機、電熱恒溫水浴鍋、UV-9000型紫外可見分光光度計。

藥品：磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、過氧化氫和愈創(chuàng)木酚為國產(chǎn)藥品；氮藍四唑(NBT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、甲硫氨酸(Met)、核黃素(VB2)。

2 試驗方法

稱取1.0 g新鮮的楊樹葉片，先用液氮進行冷凍，然后在研缽中充分碾碎，備用。

SOD活性的測定參照佟麗麗(2009)的氮藍四唑染色法，略有改動。

酶液提取：冰浴條件下，加入0.05 mol/L磷酸緩沖液6 mL，充分研磨成勻裝，4℃10000 rpm條件下離心10 min，上清液即為酶粗提取液。

活性測定：取5支玻璃試管，每管中加入磷酸緩沖液1.5 mL、130 mmol/LMet溶液0.3 mL、750 μmol/L NBT 溶液 0.3 mL、100 μmol/L EDTA 溶液 0.3 mL、20 μmol/L 核黃素0.3 mL以及蒸餾水0.25 mL。其中3支試管作為處理管各加入1 mL酶液，另2支試管作為對照管各加入1 mL磷酸緩沖液。充分混勻后，將1支對照試管置于暗處，其它各試管置于4000/X日光燈下反應20 min。反應結束后,以不照光的對照試管做空白，分別測定其它各管在560 nm處的OD值。

POD和CAT活性的測定參照何東明(2010)的愈創(chuàng)木酚法和過氧化氫氧化法，并略作修改。

POD酶液提取：加入含0.1 g PVP的磷酸緩沖液6 mL，冰浴條件下充分研磨成勻漿，4 ℃ 10000 rpm條件下離心10 min，上清液即為酶粗提取液。

POD活性測定：取1 mL愈創(chuàng)木酚溶液，加入100 μL酶粗提取液和2.9 mL磷酸緩沖液，30℃水浴30 min，加入1 mL H2O2立即于470 nm波長測OD值，以不加酶液為對照。

CAT酶液提?。杭尤隕DTA磷酸酸緩沖溶液6 mL，冰浴條件下充分研磨成勻漿，4℃ 10000 rpm條件下離心10 min，上清液即為酶粗提取液。

CAT活力測定：取30 % H2O2溶液0.6 mL定容至100 mL，取1.0 mL稀釋溶液加入1.9 mL蒸餾水和0.1 mL酶粗提液，于240 nm測OD值，以不加酶液為對照。

4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 軟件計算出酶活性的平均值和標準差，采用Univariate模型對光照強度、施肥量和生長時期進行交互效應分析。以LSD(=0.05或=0.01)檢驗3種影響因素對不同品種的楊樹之間保護酶活性的差異顯著性。

由表1可知光照強度、施肥量及生長時期對楊樹植株內CAT、POD和SOD活性均產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)。

表1 影響楊樹植株內保護性酶活性的三因素方差分析

模型擬合效果較理想R2= 0.762，0.559，0.486

由表2可知CAT的活性，不同楊樹樹種整體上均表現(xiàn)為7月份>6月份，且差異顯著(P<0.05)；SOD的活性，不同楊樹樹種均表現(xiàn)為7月份>6月份，在不同光照強度下，小葉楊、小青楊、小黑楊在施肥量為N0、N1的情況下6月和7月差異不顯著(P>0.05)，在不施肥的情況下，小黑楊在光照強度為50%和100%的情況下、在施肥量為N2情況下，3種不同品種的楊樹在光照強度為25%、50%、100%情況下均表現(xiàn)為6月和7月之間差異顯著(P<0.05)；POD的活性，不同楊樹樹種均表現(xiàn)為7月份>6月份，且差異顯著(P<0.05)。

CAT的活性，不同楊樹樹種整體上均表現(xiàn)為Ⅱ>Ⅰ>Ⅲ，6月，小葉楊和小青楊在施肥量為N1的情況下表現(xiàn)為Ⅰ與Ⅲ和Ⅱ差異顯著(P<0.05)，且Ⅰ與對照Ⅲ差異均不顯著(P>0.05)，6月，小黑楊在施肥量為N1的情況下，均表現(xiàn)為Ⅰ與Ⅲ和Ⅱ差異顯著(P<0.05)，且顯著高于對照Ⅲ。6月的其余情況下及7月，3種不同品種的楊樹在施肥量為N0、N1、N2的情況下，均表現(xiàn)為不同光照強度Ⅰ、Ⅱ之間差異顯著(P<0.05)，且顯著高于對照Ⅲ(P<0.05)。

SOD的活性，不同楊樹樹種整體上均表現(xiàn)為Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ，6月，小葉楊在不同施肥量N0、N1、N2情況下，小青楊、小黑楊在施肥量為N2的情況下，均表現(xiàn)為Ⅰ與Ⅱ和Ⅲ差異顯著(P<0.05)，且Ⅱ與對照Ⅲ差異均不顯著。在7月，3種不同楊樹在施肥量為N2的情況下，均表現(xiàn)為Ⅰ與Ⅱ、Ⅲ差異顯著(P<0.05)，且Ⅱ與對照Ⅲ差異均不顯著。6月，小青楊、小黑楊在施肥量為N0的情況下、7月，3種不同品種的楊樹在施肥量為N0、N1的情況下，均表現(xiàn)為Ⅰ、Ⅱ與Ⅲ差異極顯著(P<0.01)，且Ⅰ與Ⅱ處理組不顯著(P>0.05)，它們顯著高于對照Ⅲ(P<0.05)。7月小黑楊，在施肥量為N2的情況下，表現(xiàn)為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ處理組相互之間差異顯著(P<0.05)。

POD的活性，不同楊樹樹種整體上均表現(xiàn)為Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ，6月，小葉楊在施肥量為N1的情況下，均表現(xiàn)為Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ之間差異顯著(P<0.05)，且Ⅱ和Ⅲ對照組差異不顯著，除此之外，6月的小葉楊在施肥量為N0、N2的情況下、7月，其余楊樹在不同施肥量的情況下，均表現(xiàn)為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ之間差異顯著(P<0.05)，且Ⅰ和Ⅱ處理組差異不顯著。

不同楊樹品種的保護酶活性整體上表現(xiàn)為差異不顯著，在光照和月份一樣的情況下，除了在施肥量為N2的CAT、SOD的活性顯著高于N0和N1(P<0.05)，其余活性均不顯著(P>0.05)。

表2 光照強度和施肥量對楊樹葉片內保護酶活性的影響 (U·g-1FW·min-1, U·g-1FW)

酶SOD樹種月份ⅠⅡⅢ小葉楊6月13.1348±1.4738Aa18.0241±2.3010Ab17.2865±6.3125Ab17月17.3581±2.1472Aa110.7723±5.2985Aa18.2918±7.3124Ab1小青楊6月15.2051±2.1566Aa19.5120±3.0411Aa16.5568±7.1243Ab17月18.3541±3.5679Aa111.2031±5.3047Aa18.9912±8.3124Ab1小黑楊6月12.8345±0.3124Aa110.9167±3.3983Aa16.5625±2.6391Ab17月14.4167±1.9777Aa116.3750±8.8018Ba17.8521±8.2772Bb1

酶POD樹種月份ⅠⅡⅢ小葉楊6月43.3100±4.3672Aa125.7100±4.3315Aa119.3500±5.2783Ab17月69.6200±5.7214Ba168.1000±9.2214Ba132.4200±2.9132Bb1小青楊6月29.6500±4.4121Aa128.9000±5.8959Aa115.9100±5.5538Ab17月77.1300±5.3316Ba171.8800±9.3695Ba148.9000±3.4137Bb1小黑楊6月20.3400±3.9910Aa122.5000±3.4718Aa112.8000±6.0142Ab17月59.7800±2.3367Ba157.9700±3.1269Ba137.5600±4.3981Bb1

酶(N1)CAT樹種月份ⅠⅡⅢ小葉楊6月1.3671±0.0621Aa13.5718±0.1665Ab10.5362±0.0901Aa17月6.1578±0.0278Ba110.4319±0.9283Bb13.0012±0.1352Bc1小青楊6月1.3766±0.0779Aa14.1375±1.0263Ab10.4627±0.3005Aa17月6.2891±0.1832Ba112.3785±1.0239Bb13.9558±0.9245Bc1小黑楊6月1.3759±0.0404Aa13.7119±0.2576Ab10.5394±0.1765Ac17月6.1633±0.1450Ba111.0023±1.2259Bb13.9316±0.3382Bc1

酶SOD樹種月份ⅠⅡⅢ小葉楊6月16.1852±0.5785Aa18.1178±0.4562Ab17.3011±0.9724Ab17月14.4218±0.1552Aa110.8931±1.0279Aa18.4013±1.2264Ab1小青楊6月16.2203±1.2563Aa19.5336±0.6754Ab16.5882±1.0241Ab17月18.3712±0.8856Aa111.2189±1.0448Aa19.0576±0.8856Ab1小黑楊6月12.8526±0.6671Aa110.9341±0.8227Ab15.5908±1.0265Ab17月13.4408±1.0096Aa111.4006±1.0291Aa17.9027±0.8772Ab1

酶POD樹種月份ⅠⅡⅢ小葉楊6月43.7100±3.8912Aa125.9200±3.5672Ab122.9000±1.3425Ab17月69.8900±4.0129Ba168.4500±5.3126Ba143.6800±3.5612Bb1小青楊6月28.0200±6.1782Aa127.2100±6.7784Aa113.4000±5.1249Ab17月79.5000±4.2293Ba172.0000±5.1428Ba141.5200±7.2264Bb1小黑楊6月23.6200±2.1579Aa122.9300±1.5562Aa116.2200±4.1596Ab17月67.2200±4.5531Ba162.3500±3.7215Ba138.8800±3.1895Bb1

續(xù)表2

酶(N2)CAT樹種月份ⅠⅡⅢ小葉楊6月4.5931±0.1208Aa29.0206±0.0814Ab22.7511±0.1087Ac27月10.4782±0.0654Ba219.6548±0.4513Bb26.9685±0.2648Bc2小青楊6月4.5368±0.1083Aa29.2135±0.3064Ab22.2515±0.0538Ac27月16.7718±0.0854Ba220.2566±0.0542Bb28.0024±0.2716Bc2小黑楊6月4.4417±0.1023Aa29.1552±0.1038Ab22.3517±0.0563Ac27月15.6892±0.0882Ba220.0536±0.2773Bb26.7628±0.1725Bc2

酶SOD樹種月份ⅠⅡⅢ小葉楊6月26.8729±0.5426Aa216.4217±0.7531Ab215.9976±1.0245Ab27月31.0317±1.2543Ba222.5729±1.3325Bb221.5518±2.0419Bb2小青楊6月28.2347±1.0982Aa217.0328±1.2247Ab216.0331±1.4562Ab27月31.5832±1.5573Ba223.0591±1.3372Bb222.8947±2.0816Bb2小黑楊6月32.5528±0.8217Aa218.5894±0.8726Ab213.0928±1.4423Ab27月50.7622±1.3210Ba230.2537±1.7824Bb220.1874±3.2610Bc2

酶POD樹種月份ⅠⅡⅢ小葉楊6月31.8713±0.0534Aa122.0837±0.1224Aa118.1076±0.1178Ab17月56.1932±0.1328Ba163.0345±1.2735Ba142.7997±0.3154Bb1小青楊6月22.9033±0.0564Aa119.8821±0.3217Aa111.2567±0.2297Ab17月51.3341±0.1209Ba142.5223±1.2206Ba128.5563±0.1873Bb1小黑楊6月32.9867±0.0771Aa124.5126±0.1176Aa115.3022±0.1780Ab17月63.3400±0.0091Ba159.3500±0.1517Ba128.1600±0.2218Bb1

注：表中的數(shù)據(jù)標注為平均值±標準誤；同列不同大寫字母表示相同施肥量和相同光照強度下不同月份之間楊樹葉片內保護酶活性差異顯著(P< 0.05)；同行不同小寫字母表示同一月份和相同施肥量下不同光照強度之間保護酶活性差異顯著(P< 0.05)；不同數(shù)字表示同一月份和相同光照強度下不同施肥量之間保護酶活性差異顯著(P< 0.05)。

5 結語

不同光照和不同施肥量對保護酶活性都產(chǎn)生差異顯著，3種不同品種的楊樹在光照強度為25%、50%的情況下，CAT、SOD、POD的活性均顯著高于對照條件下的活性，CAT、SOD、POD的活性均在7月份最高。CAT在25%的情況下活性最高，SOD和POD在50%的情況下活性最高。CAT、SOD、POD在施肥量為N2的情況下活性最高，表明遮陰處理和施肥會提高楊樹體內保護酶活性。適度的控制光照強度和施肥量，能夠顯著的提高楊樹屬植物體內的防御蛋白活性，即光照強度為50%和施肥量為N2的情況下會顯著提高楊樹體內保護酶活性。

植物在長期的進化過程中，由于環(huán)境變化，結合寄主自身抗性的強弱以及昆蟲的種群數(shù)量還有植物自身所含有的抗性相關物質的長期協(xié)同防御過程中的影響，形成了獨特的防御體系。這些防御體系在抵御植物的病蟲害過程中，常常發(fā)揮著重要的作用，其中就包括保護酶、防御酶、防御蛋白抑制劑，此外還有一些酚酸、單寧類物質。因此，深入探討和研究植物抗性相關物質的影響因素，不僅在理論上能夠認識植物與昆蟲相互協(xié)作關系，還能在實踐上能夠補充和完善害蟲綜合治理的體制，為實施病蟲害生物防治技術奠定了堅實的理論基礎。本研究通過測定生長于不同光照強度和施肥量等環(huán)境影響因素對楊樹植物防御蛋白活性的影響，系統(tǒng)分析和探討光照差異和施肥差異對楊樹植物的保護酶、防御酶、和蛋白酶抑制劑的含量和活力變化。