龍 寒，禤金彩

(廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院、廣西海洋微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心、廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530008)

共生藻(Symbiodinium)是共生于海洋無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)的單細(xì)胞藻類(lèi)，依靠光合作用為宿主提供氨基酸、糖等生長(zhǎng)必需的化合物[1]。異養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)盡管能為宿主供給部分代謝能量[2]，但由于其自然來(lái)源的不穩(wěn)定性等特征，只能作為宿主的次要能量來(lái)源。因此，在含藻共生體生活史上，共生藻具有不可替代的重要性。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)共生藻的研究主要包括共生藻的分類(lèi)鑒定[3]、共生藻的逆境生理[4]、共生藻與宿主的共生機(jī)制[5]等，其中利用基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)展開(kāi)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制是共生藻研究的前沿和熱點(diǎn)，而作為PCR模板的DNA制備是對(duì)共生藻開(kāi)展分子水平研究的基礎(chǔ)。

對(duì)于共生藻DNA的提取，既有采用先與宿主分離再進(jìn)行DNA提取的方法[6]，也有采用與宿主混合采樣的提取方法[7]。在實(shí)際操作中，許多共生體(如珊瑚)由于其產(chǎn)生大量粘多糖，共生藻往往難于分離，李秀保等(2009)提出用沖洗法對(duì)活體珊瑚共生藻進(jìn)行分離[8]；張露(2017)比較了沖洗法、液氮研磨法和酒精研磨法對(duì)共生藻的分離效果，發(fā)現(xiàn)酒精研磨法分離效率高、分離質(zhì)量好[9]；張躍環(huán)等(2018)提出了用毛細(xì)管法獲得硨磲單克隆共生藻[10]。在共生藻DNA提取方面，目前常用的方法有TRIZOL提取法、CTAB提取法、改良SDS提取法等。SDS對(duì)于多糖的去除能力較差，提取效果不佳；CTAB法操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、試劑具有毒性；TRIZOL抽提法盡管樣品消耗量小操作較為簡(jiǎn)單，但苯酚、異硫氰酸胍等試劑毒性強(qiáng)，對(duì)人體及環(huán)境危害性大。

本研究采用Chelex-100樹(shù)脂法，制備可應(yīng)用于PCR的模板DNA，旨在探索一種便捷、高效、安全的共生藻DNA提取法。Chelex-100 是由苯乙烯、二乙烯苯共聚體組成的化學(xué)螯合樹(shù)脂，含有成對(duì)的亞氨基二乙酸鹽離子，可螯合多價(jià)離子，對(duì)高價(jià)金屬離子有很高的親和力和螯合作用。在低離子強(qiáng)度、堿性及煮沸的條件下，Chelex-100可以使細(xì)胞膜破裂、蛋白質(zhì)變性，能有效去除非核酸有機(jī)物，保留DNA。Chelex-100樹(shù)脂法由于其便捷性被廣泛應(yīng)用于法學(xué)鑒定如血液、血痕、組織和骨骼等DNA的提取中[11-13]，在真菌[14]、細(xì)菌[15]、放線(xiàn)菌[16]等原核生物以及高等植物[17-18]DNA提取中也有使用，但目前未見(jiàn)用于藻類(lèi)DNA提取的報(bào)道。

本研究首次將Chelex-100應(yīng)用于藻類(lèi)DNA提取，成功制備了共生狀態(tài)及純培養(yǎng)狀態(tài)下的27份共生藻樣品DNA，并通過(guò)葉綠體23S rDNA基因片段擴(kuò)增驗(yàn)證了提取效果(葉綠體23S rDNA含有演化速度很高的V區(qū)域，在共生藻種屬水平分類(lèi)上是十分有效的研究工具[19])，以期為共生藻分子分類(lèi)、功能基因研究等分子水平研究工作的效率提升提供一定的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試生物 供試生物樣品及其編號(hào)見(jiàn)表1， 純培養(yǎng)共生藻GY-H50分離自東海舟山海域。

表1 供試生物樣品及其編號(hào)Tab.1 Biological samples for experiment and numeration

1.1.2 試劑 Chelex-100的制備：將Chelex-100膠體顆粒浸泡于去離子水中，在121℃下滅菌15 min用于DNA提??；23S-M引物由北京奧科鼎盛公司合成提供，序列為23S-M/F(5’-CACGACGTTGTAAAACGACGGCTGTAACTATAACGGTCC-3’)，23S-M/R(5’-GGATAACAATTTCACACAGGCCATCGTATTGAACCCAGC-3’)[19]；新設(shè)計(jì)引物23S-N由上海生工合成提供，序列為23S-N/F(5’-CCTGCATGAAACATAGAACGATT-3’)，23S-N/R(5’-CAGGCCATCGTATTGAACCC-3’)；2×Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA marker購(gòu)自康為世紀(jì)。

1.1.3 培養(yǎng)基 共生藻GY-H50采用f/2海水培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)[20]。

f/2海水培養(yǎng)基(1 000 cm3)：NaNO375 mg，NaH2PO4·H2O 5 mg，維生素B10.1 mg，維生素B120.000 5 mg，生物素 0.000 5 mg，Na2SiO3·9H2O 30 mg，微量元素母液 1.0 cm3。

微量元素母液(1 000 cm3)：ZnSO4·7H2O 22 mg，EDTANa24.36 g，Na2MoO4·2H2O 6 mg，CuSO4·5H2O 10 mg，CoCl2·6H2O 10 mg，MnCl2·4H2O 180 mg，F(xiàn)eCl3·6H2O 3.15 g。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)取材 具有伸展組織的生物體在其自然伸展?fàn)顟B(tài)下迅速剪取小塊組織約2 mm3(如葵珊瑚的觸手、硨磲的外套膜等)；腦珊瑚、海綿用眼科剪連骨剪取約3～4 mm3的組織。剪取的組織放入裝有0.5 cm3無(wú)菌海水的EP管內(nèi)，輕輕震蕩后，將組織轉(zhuǎn)移至另一只裝有無(wú)菌海水的管內(nèi)，如此進(jìn)行3～5次清洗，最后將組織轉(zhuǎn)移至裝有0.2 cm3無(wú)菌蒸餾水的EP管內(nèi)，以滅菌解剖針對(duì)其進(jìn)行搗碎，搗碎時(shí)，可見(jiàn)管內(nèi)液體變黃。吸取黃色樣品液0.1 cm3放入PCR管內(nèi)，再加入 Chelex-100膠體顆粒25 mm3。

在生物體(硨磲、海葵、葵珊瑚等)自然伸展?fàn)顟B(tài)下迅速剪取材料，可見(jiàn)生物體仍然保持伸展?fàn)顟B(tài)，幾乎不受取樣影響，而所有的生物體在取樣后均能正常生長(zhǎng)，可見(jiàn)，此取樣方法對(duì)生物體基本不構(gòu)成傷害，能確保生物體繼續(xù)存活并可支持更多次實(shí)驗(yàn)。

取共生藻GY-H50的純培養(yǎng)藻液1 cm3，于6 000 r/min下離心10 min收集藻體，沉淀用0.1 cm3無(wú)菌水重懸后轉(zhuǎn)移至PCR管，加入Chelex-100膠體顆粒25 mm3。

1.2.2 DNA提取 樣品經(jīng)沸水浴(99～100℃)15 min后，6 000 r/min離心3 min，上清液即為DNA提取液。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及效果檢驗(yàn) PCR擴(kuò)增反應(yīng)25 mm3體系包括： 2×Taq PCR Master Mix 12.5 mm3、上游引物0.5 mm3、下游引物0.5 mm3、DNA提取液1 mm3、雙蒸水10.5 mm3。

PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性7 min；95℃變性0.5 min，55℃退火1.5 min，74℃延伸1 min 30 s，循環(huán)30次；74℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物初步檢驗(yàn)：采用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行水平電泳。電泳在120 V電壓下進(jìn)行20 min左右。以DL2000 為 marker，marker與樣品上樣量均為2 mm3。電泳結(jié)束后將凝膠置于0.5 ug/cm3EB染液中浸泡30 min顯色，再于凝膠成像儀內(nèi)260 nm紫外光下進(jìn)行拍照。

PCR產(chǎn)物測(cè)序：將電泳檢驗(yàn)中有條帶的擴(kuò)增樣品送至廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，所得序列在NCBI中進(jìn)行Nucleotide BLAST查詢(xún)比對(duì)。

1.2.4 引物設(shè)計(jì) 用序列比對(duì)軟件AlignX分析最初獲得的22條23S rDNA序列，判斷序列的保守區(qū)。選擇一條序列作為模板，載入引物設(shè)計(jì)軟件Oligo7，根據(jù)保守區(qū)選擇上游引物位置并設(shè)定預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為650 bp，Search完成引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)完成的引物通過(guò)Analyse進(jìn)行評(píng)價(jià)，確定序列。

2 結(jié)果與討論

2.1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

經(jīng)過(guò)Chelex-100樹(shù)脂熱裂解后制備所得的27份DNA樣品，取1 mm3為模板，以23S-M為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠水平電泳檢驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示，得到了22條清晰條帶的電泳圖，其中4、8、11、12、20號(hào)樣品為雙條帶，判斷原因?yàn)橐锾禺愋圆蛔阍斐桑?、5、10、15、19、21號(hào)生物樣品未擴(kuò)增出條帶。所有獲得條帶除23號(hào)樣品(750 bp)外，大小基本一致，在700 bp左右；marker及樣品上樣量均為2 mm3，從亮度對(duì)比來(lái)看，所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物具有較高的濃度，符合測(cè)序要求。

圖1 供試生物樣品共生藻及GY-H50 DNA提取物的23S-M PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 23S-M PCR products by DNA extracts from experimental biological samples’ symbiodiniums and GY-H50M：DL2000 DNA marker；1～26、GY-H50：1～26號(hào)樣品共生藻及GY-H50 DNA提取物的23S-M PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；其中，1～24對(duì)應(yīng)左側(cè)marker，25、26、GY-H50對(duì)應(yīng)右側(cè)marker。

針對(duì)未擴(kuò)增出條帶的6份樣品，利用測(cè)序返回的22份序列，按照“1.2.4”的方法進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，得到新引物23S-N。PCR所使用的模板DNA仍然采用“1.2.2”制備的DNA提取液(-20℃保存)，無(wú)需重新制備。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠水平電泳檢驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示，除3號(hào)樣品外，其余均擴(kuò)增出了700 bp左右的條帶，條帶明亮、清晰，符合測(cè)序要求。3號(hào)樣品未擴(kuò)增成功的原因，可能是所設(shè)計(jì)的引物不匹配。

圖2 部分供試生物樣品共生藻DNA提取物的23S-N PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 23S-N PCR products by DNA extracts from part experimental biological samples’ symbiodiniumsM：DL2000 DNA marker；3、5、10、15、19、21： 3、5、10、15、19、21號(hào)樣品共生藻DNA提取物的23S-N PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 擴(kuò)增序列測(cè)序結(jié)果

擴(kuò)增產(chǎn)物針對(duì)700 bp片段進(jìn)行測(cè)序，共獲得26個(gè)基因序列，將序列依次在NCBI 中進(jìn)行Nucleotide BLAST查詢(xún)比對(duì)，選擇分值最高項(xiàng)且E值最小項(xiàng)編入表2(E值是分值score的可靠性評(píng)價(jià)，即隨機(jī)情況下，其他序列與目標(biāo)序列)。從表2可以看到，所有比對(duì)結(jié)果與擴(kuò)增的目的基因一致，均為葉綠體23S rDNA，覆蓋率最低為95%，一致性最低為90%，說(shuō)明比對(duì)結(jié)果可信度高，序列擴(kuò)增正確。該結(jié)果說(shuō)明由Chelex-100樹(shù)脂熱裂解制備的模板DNA具有PCR可操作性。

從表2統(tǒng)計(jì)結(jié)果中可看到：在被測(cè)27份共生藻中，A類(lèi)群共生藻僅見(jiàn)于簾形目即番紅硨磲(Tridacnacrocea)，B類(lèi)群共生藻跨類(lèi)珊瑚目和角?？?jī)赡?，存在于氣泡菇珊?Ricordeaflorida)及角?？?Cerianthussp.)中，C類(lèi)群共生藻共生范圍跨度最大，存在于石珊瑚目、軟珊瑚目、?？?、群體?？考绊g海綿目中，東海舟山海域分離培養(yǎng)的共生藻GY-H50為E類(lèi)群共生藻，為共生藻屬中營(yíng)自由生活的種類(lèi)。本次實(shí)驗(yàn)為確保采樣種類(lèi)的多樣性，使用了3門(mén)3綱9目20科23屬26個(gè)物種作為生物樣品。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)C類(lèi)群共生藻是本次模擬調(diào)查范圍中的優(yōu)勢(shì)種，該結(jié)果與Huang等(2006)對(duì)造礁石珊瑚共生藻遺傳多樣性調(diào)查結(jié)果一致[21]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可為后續(xù)共生藻分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建、共生藻的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析以及共生關(guān)系生態(tài)學(xué)研究提供參考數(shù)據(jù)。

表2 供試生物樣品共生藻及GY-H50 的PCR擴(kuò)增序列比對(duì)結(jié)果
Tab.2 BLAST results of PCR amplified sequences from experimental biological samples’ symbiodiniums and GY-H50

編號(hào)比對(duì)結(jié)果描述最高分值總分值覆蓋率/%E值相似性/%來(lái)源1Symbiodiniumsp.Cp923SribosomalRNAgene,partialsequence;chloroplast1038103898099FJ461486.12Symbiodiniumsp.Achy17_Pool400cladeC23SribosomalRNAgene,partialsequence;chloroplast10661066990100HQ631382.14Symbiodiniumsp.Achy17_Pool400cladeC23SribosomalRNAgene,partialsequence;chloroplast10701070990100HQ631382.15Symbiodiniumsp.C1isolateCC3523SribosomalRNAgene,partialsequence;chloroplast9379371000100KR002412.16Symbiodiniumsp.clade_BisolatePk1323SribosomalRNAgene,partialsequence;chloroplastgeneforchloroplastproduct10861086980100AY055231.17Symbiodiniumsp.cladeCchloroplastgenefor23SribosomalRNA,partialsequence1081108199099AB159231.18NculturedSymbiodiniumsp.clonePavd1522c1FFS23SribosomalRNAgene,partialsequence;chloroplast30744595090KF623573.19Symbiodiniumsp.C1cpchloroplastpartial23SrRNAgene,isolate6341X10681068980100FN298482.110Symbiodiniumsp.cladeBisolateSSB0123SribosomalRNAgene,partialsequence;chloroplast9319311000100JX221048.111Symbiodiniumsp.cladeCchloroplastgenefor23SribosomalRNA,partialsequence1064106499099AB159231.112Symbiodiniumsp.cladeCchloroplastgenefor23SribosomalRNA,partialsequence61770098099AB159231.113Symbiodiniumsp.cladeCchloroplastgenefor23SribosomalRNA,partialsequence1077107799099AB159231.114Symbiodiniumsp.C1cpchloroplastpartial23SrRNAgene,isolate6341X10721072980100FN298482.1

續(xù)表2

注：3號(hào)供試生物樣品共生藻未擴(kuò)出。

2.3 討論

對(duì)于Chelex-100樹(shù)脂法，戴文申等(2006)利用該法提取痕量DNA的研究中指出，56℃保溫15～30 min、100℃保溫15 min左右(不超過(guò)30 min)有利于細(xì)胞核的裂解，促進(jìn)DNA的釋放[22]，但周雙清等(2010)在對(duì)放線(xiàn)菌進(jìn)行Chelex-100樹(shù)脂熱裂解時(shí)僅通過(guò)沸水浴10 min即獲得了良好的PCR模板DNA[23]。共生藻在共生生物體內(nèi)含量可高達(dá)3.95×106cells/cm2[24]，即使是少量的材料(如本次實(shí)驗(yàn)采樣量)，在稍加攪拌或吹打的情況下，即可見(jiàn)棕黃色的藻液被釋放出來(lái)，可見(jiàn)細(xì)胞含量充足，不屬于痕量DNA提取，因此可以縮短實(shí)驗(yàn)步驟，不進(jìn)行56℃保溫；而與原核生物相比，藻類(lèi)DNA提取又存在細(xì)胞壁破碎這一屏障，因此實(shí)驗(yàn)采用了Chelex-100樹(shù)脂熱裂解15 min提取的共生藻DNA樣品。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶明亮清晰、能夠測(cè)出有效序列，說(shuō)明Chelex-100樹(shù)脂法能夠快速實(shí)現(xiàn)腔腸動(dòng)物、海綿動(dòng)物、軟體動(dòng)物的共生藻-宿主混合樣品或者純培養(yǎng)共生藻樣品的DNA提取，且制備的模板DNA能夠滿(mǎn)足PCR擴(kuò)增需求。

值得注意的是，許多含有共生藻的生物都屬于珍稀物種[如石珊瑚、庫(kù)氏硨磲(Tridacnagigas)等]，進(jìn)行科研實(shí)驗(yàn)時(shí)，在確保完成科研工作的基礎(chǔ)上探索更合理的可持續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ绞敲恳晃豢蒲泄ぷ髡叨紤?yīng)當(dāng)充分考慮的問(wèn)題，具體做法如盡可能減少樣品的消耗量、采用不危及生物體生命的采樣方式、采用人工養(yǎng)殖代替自然采集(如果是生態(tài)調(diào)查，應(yīng)當(dāng)在滿(mǎn)足調(diào)查的同時(shí)盡可能減少取樣量)、生態(tài)調(diào)查中所取的樣品合理地放歸原環(huán)境等[25]。

3 結(jié)論

采用Chelex-100進(jìn)行了3門(mén)3綱9目20科23屬26個(gè)物種的共生藻及1株純培養(yǎng)共生藻的PCR模板DNA快速制備，并通過(guò)PCR擴(kuò)增23S rDNA基因片段進(jìn)行制備效果檢驗(yàn)，結(jié)果表明，制備過(guò)程通過(guò)Chelex-100樹(shù)脂熱裂解15 min，即能為26份樣品提供合格的PCR擴(kuò)增DNA模板(有1份樣品未能擴(kuò)增成功判斷原因?yàn)橐锊黄ヅ?。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明Chelex-100樹(shù)脂法能夠用于多種狀態(tài)及類(lèi)型共生藻的PCR模板DNA制備，且具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、無(wú)污染、無(wú)設(shè)備要求、樣品消耗量小等優(yōu)點(diǎn)。