鮑坤，王曉旭，王凱英，李光玉

（中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，長春 130112）

銅是動物正常生長發(fā)育和生產(chǎn)所必需的微量元素。動物體內(nèi)銅元素不足會引起相應的營養(yǎng)代謝疾病[1]。不同動物銅缺乏以后會產(chǎn)生不同的癥狀。梅花鹿缺銅后，腦脊髓神經(jīng)纖維鞘變性、壞死，部分神經(jīng)元萎縮、變性，血管壁膠原纖維增生，血管壁肥厚、結(jié)構(gòu)疏松，血管內(nèi)膜粗糙，管壁變窄以致阻塞，因而導致運動失調(diào)，俗稱“晃腰病”[2]。銅元素具有抗氧化功能，其抗氧化作用主要通過對機體抗氧化酶的影響來實現(xiàn)。機體含有很多含銅的酶，其中反應較靈敏的有銅鋅超氧化物歧化酶（CuZn-SOD）、銅藍蛋白（CER）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，此外，血清中脂質(zhì)過氧化物（LPO）和丙二醛（MDA）含量也是衡量動物抗氧化性能的一個重要指標。本試驗的目的是通過研究銅缺乏梅花鹿體內(nèi)主要抗氧化酶活性的變化，為進一步闡明銅缺乏癥梅花鹿的發(fā)病機理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及補銅試驗

在吉林市某大型梅花鹿養(yǎng)殖場，選擇患共濟失調(diào)癥比較嚴重的 10 頭梅花鹿（發(fā)病組），平均體重為82.25±2.28 kg，采集血液樣品。抽取該鹿場同年生鹿全血，對銅含量進行抽樣檢測，選擇全血銅含量低于NRC標準（1985 年）[3]下限（0.8 mg/kg）、但無明顯搖擺癥狀的鹿15 頭作為亞臨床缺銅組，對其進行補銅試驗（飼料中添加蛋氨酸銅40 mg/kg 干重，由長沙興嘉生物工程股份有限公司提供）。以吉林市健康地區(qū)某鹿場25 頭臨床健康鹿作為對照組，分別于試驗40 d 和80 d將鹿麻醉后，頸靜脈采集血液樣本，離心后用于相關(guān)指標的檢測。同時，采集全血，用于測定血中自由基含量。

1.2 測定項目與方法

血清Cu Zn-SOD活性用黃嘌呤氧化酶法測定；血清GSH-Px 活性采用2-硝基苯甲酸（DTNB）顯色法測定；血清CER 活性采用聯(lián)大茴香胺比色法測定；血清LPO活性采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法測定；MDA含量采用分光光度計法測定；血清中一氧化氮（NO）含量采用硝酸還原酶法測定；全血中總自由基的相對含量采用ESR 法測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

結(jié)果均以平均值±標準差表示，試驗數(shù)據(jù)使用SAS 9.1 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，采用Duncan 氏法進行多重比較，P ＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅缺乏對梅花鹿血清抗氧化酶活性的影響

各組梅花鹿血清中主要抗氧化酶活性及血清中LPO 含量的測定結(jié)果見表1。

由表1 可知，發(fā)病組梅花鹿GSH-Px 活性顯著低于亞臨床缺銅組及對照組（P ＜0.05），亞臨床缺銅組和對照組GSH-Px 活性差異不顯著（P ＞0.05）；發(fā)病組、亞臨床缺銅組和對照組CuZn-SOD及CER活性均差異顯著（P＜0.05），且發(fā)病組這2 種酶的活性最低；發(fā)病組梅花鹿的LPO 含量顯著高于亞臨床缺銅組及對照組（P ＜0.05），亞臨床缺銅組的LPO 含量與對照組相比差異不顯著（P ＞0.05）；發(fā)病組MDA 含量顯著高于亞臨床缺銅組和對照組（P ＜0.05），而亞臨床缺銅組和對照組間差異不顯著（P ＞0.05）。

表1 銅缺乏對梅花鹿血清抗氧化酶活性及脂質(zhì)過氧化物含量的影響Table 1 Effects of copper deficiency on the activities of serum antioxidant enzymes and pipid peroxide content in sika deer

2.2 補銅前、后血清中主要抗氧化指標的變化

補銅前、后對照組與亞臨床缺銅組梅花鹿血清GSH-Px、CuZn-SOD、CER 活性和 LPO 含量的變化見表2。

表2 補銅前、后對照組和亞臨床缺銅組梅花鹿血清抗氧化酶活性和LPO 含量的變化Table 2 Changes of serum antioxidant enzymes’activity and LPO content of sika deer before and after copper supplement in control group and diseased group

由表2 可以看出，亞臨床缺銅組補銅后血清GSHPx 活性有明顯提高，補銅前、后GSH-Px 活性差異顯著（P＜0.05）；發(fā)病組血清CuZn-SOD活性在補銅前、后差異顯著（P ＜0.05），但在補銅80 d 時與對照組相比差異不顯著（P ＞0.05）；發(fā)病組血清CER 活性在補銅前、后有顯著差異（P ＜0.05）；發(fā)病組血清LPO 含量在補銅前、后差異顯著（P＜0.05），但在補銅80 d時與對照組相比LPO 含量差異不顯著（P ＞0.05）；發(fā)病組血清MDA含量在補銅后顯著下降，但其在補銅80 d時與對照組相比MDA 含量差異不明顯（P ＞0.05）。

2.3 補銅前、后全血自由基及血清NO含量的變化

補銅前、后梅花鹿全血自由基及血清NO 含量的變化如表3 和表4 所示。由表3 可以看出，在補銅后，對照組的全血自由基含量差異不顯著（P ＞0.05）；亞臨床缺銅組隨著補銅的進行，全血中自由基含量逐漸降低，差異達到顯著水平（P ＜0.05），補銅80 d 時亞臨床缺銅組自由基含量稍高于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。

表3 補銅前、后梅花鹿全血自由基相對含量的變化Table 3 Changes of free radicals cotent in whole blood of sika deer before and after copper supplementation

由表4 可以看出，在補銅后，對照組的血清NO含量差異不顯著（P ＞0.05）；亞臨床缺銅組隨著補銅的進行，血清NO 含量逐漸降低，達到差異顯著水平（P ＜0.05），稍高于對照組含量，差異不顯著。

表4 補銅前、后梅花鹿血清NO 含量的變化Table 4 Changes of serum NO content in sika deer before and after copper supplementation （nmol/L）

3 討論

銅是動物所必需的微量元素之一，對動物的生長和生產(chǎn)過程中發(fā)揮著重要作用，對于動物的生產(chǎn)性能、繁殖性能以及免疫功能和抗氧化性能等都有很重要的影響。若銅缺乏，則會使動物正常生理活動受到影響，進而影響其生產(chǎn)性能。梅花鹿在正常情況下機體的抗氧化能力和氧自由基的氧化能力保持著動態(tài)平衡關(guān)系。當抗氧化能力下降或者自由基產(chǎn)生異常增多時，會導致組織的氧化損傷，從而導致疾病發(fā)生[4-5]。

血液中抗氧化活性指標很多，GPX、CuZn-SOD、CER、LPO 和MDA 都是重要的抗氧化指標。機體如果出現(xiàn)缺銅，則GPX和CuZn-SOD 的活性均會降低[6]。本試驗結(jié)果與以上研究結(jié)果相一致。本試驗結(jié)果表明，亞臨床缺銅組梅花鹿GSH-Px、CuZn-SOD 活性均顯著低于對照組及亞臨床缺銅組。發(fā)病梅花鹿體內(nèi)抗氧化酶水平降低導致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物相對過剩，活性氧增多，誘發(fā)脂質(zhì)過氧化并攻擊生物膜系統(tǒng)[7]，補銅后，這一現(xiàn)象得到明顯改善。

CER 的主要功能是運輸銅，同時還起著抗氧化劑的作用。血清CER 的水平反映著機體各方面的生理和病理狀態(tài)，測定CER水平，對機體的機能、代謝均具有重要意義[8]。關(guān)于梅花鹿機體內(nèi)CER 含量的相關(guān)報道較少，王水琴等[9]測定了吉林雙陽地區(qū)健康鹿和病鹿的CER 活性發(fā)現(xiàn)，二者CER 活性差異顯著。鮑坤等[10]通過在生長期梅花鹿日糧中添加蛋氨酸螯合銅，顯著提高了血清中CER 的活性。以上結(jié)果與本試驗結(jié)果相一致，說明缺銅會導致梅花鹿血清CER活性降低，在梅花鹿日糧中添加銅元素會提高CER 的活性。其他家畜中的研究結(jié)果[11-13]也證實了這一點。

MDA 是衡量脂質(zhì)過氧化的重要指標。宴家友等[11]認為，在仔豬日糧中添加檸檬酸銅可以顯著降低仔豬血清中MDA 的含量，提示檸檬酸銅可以增強機體的抗氧化能力。Zhang 等[14]對絨山羊的研究表明，在飼糧中添加銅能夠降低血清中MDA 的濃度。武福平等[15]開展了補銅對銅缺乏奶牛血漿7 項生化指標的影響研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補銅后血漿MDA 水平顯著低于補銅前。本試驗結(jié)果表明，補銅后亞臨床缺銅組梅花鹿體內(nèi)MDA 含量逐步降低，在補銅80 d 時血清MDA 含量達到對照組的正常水平，說明銅的添加能夠改善血清中MDA的含量，提高機體抗氧化水平，與前人研究結(jié)果相一致。

迄今為止，國內(nèi)、外尚未見到關(guān)于銅缺乏梅花鹿自由基的堆積引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷的機理研究報道。為證實梅花鹿抗氧化性能降低是否與體內(nèi)氧自由基堆積有關(guān)，本試驗測定了發(fā)病梅花鹿及健康梅花鹿全血中自由基的含量，并通過測定亞臨床銅缺乏在補銅前、后的變化來闡明梅花鹿銅缺乏與自由基代謝的關(guān)系。補銅后，對照組全血自由基的含量差異不顯著（P＞0.05）；亞臨床缺銅組隨著補銅的進行，全血中自由基含量逐漸降低，差異達到顯著水平（P＜0.05）；補銅80 d時發(fā)病組自由基含量恢復到正常水平，與對照組差異不顯著。由此可見，日糧中補銅可使亞臨床銅缺乏梅花鹿體內(nèi)自由基含量降低，這與柴春彥等[16]在奶牛上的研究結(jié)果相一致。

對于發(fā)病梅花鹿血清NO含量，從補銅效果來看，亞臨床缺銅組梅花鹿在補銅后血清中NO水平顯著降低，且與對照組相比無顯著差異，說明患病梅花鹿在補銅后血清內(nèi)NO 含量能夠恢復到正常水平，與柴春彥等[16]在奶牛上的研究結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

在患有缺銅癥狀的梅花鹿日糧中添加銅元素，能夠提高梅花鹿血清中CER、CuZn-SOD、GPX 的活性，降低血清中自由基及NO 的含量，使梅花鹿機體的抗氧化性能得到改善。