李 波， 鄔婷婷， 方志堅， 李 紅， 楊 曌， 林 浩

(1. 齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院， 黑龍江 齊齊哈爾161005)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一種多年生豆科牧草，具有產(chǎn)草量高、利用年限長、再生性強、適口性好、營養(yǎng)豐富等特點，世界范圍內(nèi)廣泛種植，在干旱和鹽堿環(huán)境下生長良好，還可以作為綠肥改良土壤，有利于農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的改善[1]。鹽堿土作為一種土壤類型分布廣泛，土地鹽堿化問題已經(jīng)成為影響世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的最主要非生物脅迫之一，嚴重影響農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)，因此提高牧草的耐鹽堿性是改良鹽堿地的一項有效措施，是影響區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展和生態(tài)恢復(fù)的重要因素[2]。當(dāng)植物受到鹽堿等逆境脅迫后，可對鹽堿等逆境的適應(yīng)性增強，體內(nèi)的礦質(zhì)元素發(fā)生改變，通過改變礦質(zhì)元素含量達到降低逆境脅迫對植物造成的傷害[3-4]。脫落酸(Abscisic acid，ABA)是一種重要的植物激素，在植物的非生物脅迫應(yīng)答中起重要作用，ABA可通過影響細胞膜透性或主動吸收過程直接影響礦質(zhì)元素的吸收，也可通過影響植物生長增強或減弱對礦質(zhì)元素的吸收[5]。滲透脅迫下，Ca作為第2信使刺激植株產(chǎn)生ABA，ABA大量積累導(dǎo)致植株氣孔關(guān)閉，蒸騰速率降低，除此之外，ABA能促進胞外Ca2+內(nèi)流，使胞內(nèi)Ca2+濃度上升，同時，它與鈣調(diào)蛋白結(jié)合導(dǎo)致蛋白激酶活化，使細胞伸長生長[6-7]。激素與礦質(zhì)元素的協(xié)同作用在調(diào)節(jié)植物水分平衡和誘導(dǎo)脅迫耐性等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[8]。本文選取具有一定抗鹽堿性的紫花苜蓿為材料，采用模擬鹽堿脅迫的方法，探討外施ABA對苜蓿幼苗各營養(yǎng)器官的Na+，K+，Ca2+，Mg2+含量和這些離子在各器官的分布變化趨勢，從離子平衡方面探討ABA對苜蓿耐混合蘇打鹽堿的差異，以期對苜蓿在混合蘇打鹽堿脅迫下的抗性機制有更深入的認識。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以黑龍江省畜牧研究所提供的WL343HQ紫花苜蓿種子為材料。WL343HQ紫花苜蓿是從美國引進的，具有高產(chǎn)、高品質(zhì)和耐鹽堿等特點。

1.2 試驗方法

1.2.1苜蓿幼苗培養(yǎng) 選取WL343HQ苜蓿種子，采用土培(體積比,針葉土∶營養(yǎng)土∶珍珠巖=1∶2∶0.5，營養(yǎng)土中N+P2O5+K2O≥4%)的方法均勻播種于塑料花盆(上沿直徑為27 cm，下底直徑為15 cm，高為14 cm)中，每盆播種30粒種子，出苗后進行間苗，保證每盆中留下10株幼苗，待幼苗培養(yǎng)至高度為15～20 cm時進行混合蘇打鹽堿和ABA處理。

1.2.2幼苗混合蘇打鹽堿脅迫和ABA處理 用濃度為150 mmol·L-1的混合蘇打鹽堿溶液[9](NaHCO3∶Na2CO3=9∶1)對苜蓿幼苗進行根部澆灌，每3 d補充澆灌1次，脅迫1周，對照組(T1)澆灌等量蒸餾水。如表1，分別使用0，25，50，75和100 μmol·L-15個濃度[9]的ABA溶液(其中0為噴等量的蒸餾水)對受到混合蘇打鹽堿脅迫的苜蓿幼苗在避光條件下進行噴施，每3 d噴施1次[9]，共緩解2次。第2次緩解結(jié)束后3 d采集樣品，將植株根、莖、葉分離，置于密封袋中，-80 ℃保存?zhèn)溆茫總€處理均3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 混合蘇打鹽堿和ABA具體處理濃度Table 1 Mixed soda salt-alkaline and ABA treatment concentration

1.2.3礦質(zhì)元素含量的測定 采用ICE 3500原子吸收光譜儀(深圳市瑞盛科技有限公司，2012)對樣品的Na+，K+，Ca2+，Mg2+含量進行測定。

測定標(biāo)準曲線：配置1 mg·L-1，5 mg·L-1，10 mg·L-1的Na+，K+，Ca2+，Mg2+金屬標(biāo)準液，通過測定其吸光度繪制標(biāo)準曲線。

樣品的預(yù)處理：取足量鮮樣陰干，陰干至恒重后置于120 ℃的烘箱內(nèi)烘干至恒重后，研磨成粉。取0.2 g樣品，加入1 mL濃HCl和3 mL濃硝酸進行硝化，硝化所得溶液備用。

礦質(zhì)元素含量的測定和計算：測定消化溶液的吸光值，并代入標(biāo)準曲線，可求得樣品中金屬離子的含量。結(jié)果計算：W=m/M，式中：W：礦質(zhì)元素含量；m：從標(biāo)準曲線中查得的金屬離子的含量；M：所測定樣品的含有的樣品量。

1.2.4數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)用SPSS 19.0和Excel 2010軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分(One-way ANOVA)和新復(fù)極差法(Duncan)比較同一品種的不同處理間的差異顯著性，P<0.05時有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)值為平均值±標(biāo)準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABA對混合蘇打鹽堿脅迫苜蓿幼苗的礦質(zhì)元素含量的影響

ABA對受混合蘇打鹽堿脅迫的苜蓿幼苗的Na+含量影響如圖1A所示。T2混合蘇打鹽堿脅迫處理組苜蓿幼苗各器官的Na+含量明顯高于T1處理組未受脅迫的幼苗，T2處理組根、莖和葉的Na+含量較T1處理組分別增加了80.92%，1003.83%和325.65%。經(jīng)不同濃度的ABA處理(T3～T6)后混合蘇打鹽堿脅迫苜蓿幼苗的各器官中Na+含量均低于T2處理組的苜蓿幼苗，其中根的Na+含量較T2處理組分別降低了34.76%，28.87%，23.01%和14.55%，莖的Na+含量較T2處理組分別降低了12.27%，28.44%，45.66%和63.42%，葉中的Na+含量較T2處理組分別降低了15.37%，20.21%，26.44%和32.23%；根中的Na+含量隨ABA濃度增加呈上升趨勢，莖和葉的Na+含量隨著ABA濃度的升高而下降。對不同濃度ABA處理下的苜蓿幼苗的營養(yǎng)器官的Na+含量進行方差分析得出，各營養(yǎng)器官中的Na+含量差異顯著(P<0.05)，這表明不同ABA處理濃度對苜蓿幼苗各營養(yǎng)器官的Na+含量有較大的影響，各器官中Na+含量從高到低的順序為莖>葉>根。

ABA對受混合蘇打鹽堿脅迫的苜蓿幼苗的K+含量影響如圖1B所示。T2混合蘇打鹽堿脅迫處理組苜蓿幼苗根和葉的K+含量明顯低于T1處理組未受脅迫的幼苗，莖中的K+含量則高于T1組，T2處理組根、葉的K+含量較T1處理組分別降低了69.52%和27.89%，而莖中的K+含量則增加了17.12%。經(jīng)不同濃度的ABA處理(T3～T6)后的混合蘇打鹽堿脅迫的苜蓿幼苗除ABA處理濃度為25 μmol·L-1的葉外的各器官中K+均高于T2處理組的苜蓿幼苗，其中T3～T6處理組根部的K+含量較T2處理組分別增加了33.28%，49.65%，85.03%和105.53%，莖的K+含量較T2處理組分別增加了4.55%，3.23%，2.63%和4.34%，在ABA濃度為25 μmol·L-1時，葉中的K+含量較T2處理組降低了1.84%，在ABA濃度高于50 μmol·L-1時，葉中K+含量較T2處理組分別增加了23.33%，55.44%和93.46%。根和葉的K+含量隨ABA濃度增加而增加，莖中的K+含量隨著ABA濃度的升高無明顯變化。對不同濃度ABA處理下的苜蓿幼苗的營養(yǎng)器官的K+含量進行方差分析得出，根和葉中的K+含量在各組之間差異顯著(P<0.05)，而莖中的K+含量在各組之間差異不顯著(P>0.05)，這表明不同ABA處理濃度對苜蓿幼苗根和葉的K+含量有較大的影響，對莖中的K+含量影響不大，各器官中K+含量從高到低的順序為莖>葉>根。

ABA對受混合蘇打鹽堿脅迫的苜蓿幼苗的Ca2+含量影響如圖1C所示。T2混合蘇打鹽堿脅迫處理組苜蓿幼苗根的Ca2+含量明顯高于T1組未受脅迫的幼苗，莖和葉的Ca2+含量則低于T1處理組。T2處理組根中的Ca2+含量較T1處理組增加了186.69%，莖和葉的Ca2+含量較T1處理組則分別降低了7.85%和3.22%。經(jīng)不同濃度的ABA處理(T3～T6)后的受到混合蘇打鹽堿脅迫的苜蓿幼苗各器官中Ca2+均高于T2處理組的苜蓿幼苗，其中根部的Ca2+含量較T2處理組分別增加14.25%，31.84%，48.54%和65.93%，莖的Ca2+含量較T2處理組分別增加了57.68%，56.59%，58.79%和55.26%，葉中的Ca2+含量較T2處理組分別增加了58.64%，62.61%，66.09%和70.55%；根和葉的Ca2+含量隨ABA濃度增加而增加，莖中的Ca2+含量隨著ABA濃度的增加無明顯變化。對不同濃度ABA處理下的苜蓿幼苗的營養(yǎng)器官的Ca2+含量進行方差分析得出，根和葉中的Ca2+含量各組之間差異顯著(P<0.05)，而莖中的Ca2+含量各組之間差異不顯著(P>0.05)，這表明不同ABA處理濃度對苜蓿幼苗根和葉的Ca2+含量有較大的影響，對莖中的Ca2+含量影響不大。各器官中Ca2+含量從高到低的順序為根>葉>莖。

ABA對受混合蘇打鹽堿脅迫的苜蓿幼苗的Mg2+含量影響如圖1D所示。T2混合蘇打鹽堿脅迫處理組苜蓿幼苗根的Mg2+含量明顯低于T1處理組未受脅迫的幼苗，莖和葉的Mg2+含量則高于T1處理組。T2處理組根中的Mg2+含量較T1處理組降低了11.83%，而莖和葉的Mg2+含量較T1處理組分別增加了119.62%和123.60%。經(jīng)不同濃度的ABA處理(T3～T6)后混合蘇打鹽堿脅迫苜蓿幼苗各器官中Mg2+含量均高于T2處理組的苜蓿幼苗，其中根部的Mg2+含量較T2處理組分別增加了112.88%，159.93%，200.36%和267.80%，莖的Mg2+含量較T2處理組分別增加了63.98%，112.68%，163.11%和208.79%，葉中的Mg2+含量較T2處理組分別增加了25.68%，61.91%，98.43%和152.28%；根、莖和葉的Mg2+含量隨ABA濃度增加而增加。對不同濃度ABA處理下的苜蓿幼苗的營養(yǎng)器官的Mg2+含量進行方差分析得出，各器官中的Mg2+含量在各組之間差異顯著(P<0.05)，這表明不同ABA處理濃度對苜蓿幼苗根和葉的Mg2+含量有較大的影響，各器官中Mg2+含量從高到低的順序為葉>莖>根。

圖1 ABA對混合蘇打鹽堿脅迫苜蓿幼苗礦質(zhì)元素含量的影響Fig.1 Effects of ABA on mineral elements content in alfalfa seedlings under mixed soda salt-alkaline stress注：相同營養(yǎng)器官不同處理間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters between different treatments of the same vegetative organs indicate significant differences at the 0.05 level,the same below

2.2 ABA對混合蘇打鹽堿脅迫苜蓿幼苗礦質(zhì)元素比值的影響

ABA對受混合蘇打鹽堿脅迫的苜蓿幼苗的Na+/K+比值影響如圖2A所示。T2混合蘇打鹽堿脅迫處理組苜蓿幼苗的各營養(yǎng)器官Na+/K+的比值均明顯高于T1處理組未受混合蘇打鹽堿脅迫的幼苗，T2處理組根、莖和葉中的Na+/K+較T1處理組分別增加了491.60%，829.51%和486.15%；經(jīng)不同濃度的ABA處理(T3～T6)后的受到混合蘇打鹽堿脅迫的苜蓿幼苗各器官中的Na+/K+比值均低于T2處理組的苜蓿幼苗，T3～T6處理組根中的Na+/K+較T2處理組分別降低了50.97%，52.52%，58.32%和58.32%，莖中Na+/K+分別降低了16.05%，30.69%，47.09%和65.08%，葉中Na+/K+分別降低了13.65%，35.17%，52.49%和64.83%；各器官中的Na+/K+比值均隨著ABA濃度的升高而下降。方差分析顯示，除根中ABA濃度為75和100 μmol·L-1兩組差異不顯著外(P>0.05)，其它各組之間差異均顯著(P<0.05)，表明不同ABA處理濃度對苜蓿幼苗各器官的Na+/K+的比值有較大的影響。

ABA對受混合蘇打鹽堿脅迫的苜蓿幼苗的Na+/Ca2+比值影響如圖2B所示。T2混合蘇打鹽堿脅迫處理組苜蓿幼苗的根的Na+/Ca2+的比值明顯低于T1處理組未受混合蘇打鹽堿脅迫的幼苗，莖和葉的Na+/Ca2+的比值則高于T1處理組；根中的Na+/Ca2+的比值較T1處理組降低了36.68%，莖和葉中Na+/Ca2+的比值較T1處理組分別增加了1090.11%和532.10%；經(jīng)不同濃度的ABA處理(T3～T6)后的受到混合蘇打鹽堿脅迫的苜蓿幼苗各器官中的Na+/Ca2+比值均低于T2處理組的苜蓿幼苗，T3～T6處理組根中的Na+/Ca2+的比值較T2處理組分別降低了42.76%，46.21%，48.28%和48.28%，莖中Na+/Ca2+的比值較T2處理組分別降低了44.32%，54.29%，65.74%和76.45%，葉中Na+/Ca2+的比值較T2處理組分別降低了46.68%，50.98%，55.86%和60.35%；各器官中的Na+/Ca2+比值均隨著ABA濃度的升高而下降。方差分析顯示，除根中ABA濃度為75和100 μmol·L-1兩組差異不顯著外(P>0.05)，其它各組之間差異均顯著(P<0.05)，這表明不同ABA處理濃度對苜蓿幼苗各器官的Na+/Ca2+的比值有較大的影響。

ABA對受混合蘇打鹽堿脅迫的苜蓿幼苗的Na+/Mg2+比值影響如圖2C所示。T2混合蘇打鹽堿脅迫處理組苜蓿幼苗的各器官的Na+/Mg2+的比值均明顯高于T1處理組未受混合蘇打鹽堿脅迫的幼苗，T2處理組根、莖和葉中的Na+/Mg2+的比值較T1處理組分別增加了105.18%，402.48%和90.34%；經(jīng)不同濃度的ABA處理(T3～T6)后的受到混合蘇打鹽堿脅迫的苜蓿幼苗各器官中的Na+/Mg2+的比值均低于T2處理組苜蓿幼苗，T3～T6處理組根中的Na+/Mg2+的比值較T2處理組分別降低了69.34%，72.64%，74.37%和76.75%，莖中Na+/Mg2+的比值較T2處理組分別降低了46.48%，66.36%，79.34%和88.15%，葉中Na+/Mg2+的比值較T2處理組分別降低了32.64%，50.73%，62.93%和73.13%；各器官中的Na+/Mg2+比值均隨著ABA濃度的升高而下降。方差分析顯示，苜蓿幼苗的各器官中的Na+/Mg2+的比值差異均顯著(P<0.05)，這表明不同ABA處理濃度對苜蓿幼苗各器官的Na+/Mg2+的比值有較大的影響。

圖2 ABA對混合蘇打鹽堿脅迫的苜蓿幼苗礦質(zhì)元素比值的影響Fig.2 Effects of ABA on mineral elements ratio of alfalfa seedlings under mixed soda salt-alkaline stress

3 討論

3.1 混合蘇打鹽堿脅迫對苜蓿幼苗礦質(zhì)元素含量的影響

在鹽堿脅迫下，植物根系土壤存在嚴重的離子失衡，這使得植物體內(nèi)的離子平衡狀態(tài)發(fā)生明顯的變化，Na+，K+，Ca2+，Mg2+的含量均會受其影響。受到混合蘇打鹽堿脅迫的植物體內(nèi)會積累大量的Na+，同時K+缺乏[10]，非鹽生植物的耐鹽性和阻止鹽離子吸收的基本策略是地上部分拒鹽，將鹽離子隔離積累在根、莖部位，阻止Na+在地上部分的過度積累。在本試驗中，除根中的K+、莖中Ca2+、葉中的K+，Ca2+外，受混合蘇打鹽堿脅迫的苜蓿幼苗各營養(yǎng)器官中的Na+，K+，Ca2+，Mg2+含量均明顯高于未受脅迫的苜蓿幼苗。這與王志春等[11]、黃立華等[12]、王小山等[13]、張麗等[14]的研究結(jié)果相似，這表明混合蘇打鹽堿脅迫促進了苜蓿幼苗的Na+吸收，并且使幼苗的根莖葉中大量積累Na+，與之相對應(yīng)的是K+在根和葉中的積累顯著減少，這說明混合蘇打鹽堿脅迫抑制苜蓿幼苗對K+的吸收，而在莖中的K+含量上升、葉片中K+含量下降則說明為應(yīng)對混合蘇打鹽堿脅迫，植物從根部向上運輸K+，但混合蘇打鹽堿脅迫會促進Na+的吸收同時抑制葉片對K+的吸收。Ca2+是植物細胞中重要的信號物質(zhì)[15]，且對細胞膜有維護作用[16]，本試驗中Ca2+受到混合蘇打鹽堿脅迫的苜蓿幼苗根部的Ca2+含量上升，而莖、葉中的Ca2+含量下降，這表明混合蘇打鹽堿脅迫可造成苜蓿根部對Ca2+積累增加，而使莖、葉中的Ca2+流失，這可能是因為在為保護直接暴露在鹽堿脅迫環(huán)境的根部，植物在根部積累了大量的Ca2+，而在莖、葉中細胞內(nèi)Ca2+被Na+置換出去從而導(dǎo)致了莖葉中的Ca2+流失。Mg2+是葉綠素分子的重要組成部分，與鹽堿脅迫下光合作用的相關(guān)變化有一定的關(guān)聯(lián)[17]，本試驗中，Mg2+在根中的含量下降，在莖葉中的含量增加。

植物體內(nèi)金屬離子含量的變化，會引起各種離子的比例發(fā)生變化。在本試驗中，由于受混合蘇打鹽堿脅迫的苜蓿幼苗各營養(yǎng)器官中Na+含量大幅增加，所以與未受脅迫的苜蓿幼苗相比，Na+/K+，Na+/Ca2+，Na+/Mg2+的比值均大幅提升，這表明混合蘇打鹽堿脅迫提高了Na+在植物苜蓿幼苗體內(nèi)的相對含量，加強了Na+對植物造成的毒害作用。

3.2 ABA對受混合蘇打鹽堿脅迫苜蓿幼苗礦質(zhì)元素含量的影響

ABA對植物耐鹽性的提升方式之一就是影響植物的離子吸收，有關(guān)研究表明，ABA可以通過提高Na+-K+ATPase的活性和促進線粒體吸氧速率，增強Na+和K+選擇性運輸，促進葉綠素合成[18]，開啟Ca2+通道，增加Ca2+濃度，促進其和鈣調(diào)蛋白的結(jié)合[19]。在本試驗中，與未經(jīng)ABA處理的苜蓿幼苗相比，經(jīng)ABA處理的WL343HQ苜蓿幼苗根部的Na+含量隨ABA處理濃度的增加而增加，而莖、葉中的Na+濃度隨ABA處理濃度的增加而降低，但各器官的Na+含量均遠低于未經(jīng)ABA處理的苜蓿幼苗。K+含量在根和葉中的變化均隨ABA處理濃度的增加而增加，除在ABA濃度為25 μmol·L-1葉的K+含量以外，其它處理組別均高于同部位未經(jīng)ABA處理的苜蓿幼苗的K+含量，莖的K+含量均顯著高于對照組，但其含量并不受ABA濃度的影響。這與郭小俊等[20]、周繼華等[21]的研究得出的結(jié)論相似；這些結(jié)果表明，ABA可以降低植物體內(nèi)的Na+積累，增加K+來調(diào)控植物的離子平衡。根中的Na+含量顯著高于莖和葉，這表明ABA會抑制Na+向地上部分運輸，將Na+所造成的離子毒害范圍縮小在根部。高濃度的Na+將具有保護質(zhì)膜作用的Ca2+取代，質(zhì)膜選擇透性降低，Na+大量內(nèi)流，造成離子毒害，而胞質(zhì)中Ca2+對Na+的解毒是必須的，因此，根部Ca2+大量積累，明顯高于莖和葉，通過質(zhì)膜外排作用降低Na+毒害作用，該研究結(jié)果與劉正祥等[22]的結(jié)果一致。Na+與Ca2+和Mg2+主要表現(xiàn)為拮抗作用，根部Na+含量較高，相對的Mg2+含量較低，植株進行光合作用時，由于Mg2+的供應(yīng)主要集中在莖葉部，導(dǎo)致根部Mg2+供應(yīng)缺乏[23]，同樣與未經(jīng)ABA處理苜蓿幼苗相比，經(jīng)ABA處理的幼苗的Ca2+和Mg2+在根、莖、葉的含量均高于對照組，且隨著ABA處理濃度的增加而增加。這與楊躍霞等[24]的研究結(jié)果部分相符。本試驗結(jié)果表明，ABA會促進根部對Ca2+和Mg2+的吸收，并增加Ca2+和Mg2+在植物莖和葉中的積累。

由于外源ABA抑制了Na+在受混合蘇打鹽堿脅迫的苜蓿幼苗體內(nèi)的積累，同時提升了K+，Ca2+和Mg2+在苜蓿幼苗體內(nèi)的積累。因此，在經(jīng)各濃度ABA處理苜蓿幼苗的各營養(yǎng)器官中，Na+/K+、Na+/Ca2+和Na+/Mg2+的比值均大幅下降，并且隨著ABA濃度的升高而降低，這表明ABA可降低Na+在苜蓿幼苗體內(nèi)相對含量，這種作用會隨著ABA濃度的升高而加強，因此，ABA可有效緩解Na+對苜蓿幼苗的脅迫作用。

4 結(jié)論

WL343HQ苜蓿幼苗在150 mmol·L-1混合蘇打鹽堿脅迫下，各營養(yǎng)器官Na+含量、莖的K+含量、根的Ca2+含量、莖和葉的Mg2+含量均增加，葉的K+含量、莖和葉的Ca2+含量以及根的Mg2+含量均降低；隨著ABA處理濃度的增加，根和葉中K+、Ca2+與各營養(yǎng)器官Mg2+含量增加，降低莖和葉的Na+含量以及Na+/K+，Na+/Ca2+和Na+/Mg2+比值，而莖中的K+，Ca2+含量與未經(jīng)ABA緩解處理組顯著增加，但受ABA濃度影響不明顯。綜上可知，混合蘇打鹽堿脅迫影響苜蓿幼苗對Na+，K+，Ca2+，Mg2+在根、莖、葉營養(yǎng)器官的分布，而ABA增加或降低了各營養(yǎng)器官的離子含量，即ABA緩解了紫花苜蓿對混合蘇打鹽堿脅迫的耐受性。