人乳頭狀瘤病毒相關(guān)性p16INK4A在口咽鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及對其療效的影響

陳志萍 李金高 彭世義 羅慶豐 曾 平 李國慶 吳新生 李 俊 高 文 陳俊京

人類乳頭狀瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是一種致瘤性DNA病毒，在宮頸癌中已被公認(rèn)為重要的致癌因素[1]。近些年發(fā)現(xiàn)HPV感染與口咽部鱗狀細(xì)胞癌(OPSCC)存在密切相關(guān)性。既往報道歐美發(fā)達(dá)國家OPSCC患者HPV感染率為50%～70%，被認(rèn)為是繼吸煙、 飲酒之后的第三大致癌因素[2-8]。HPV表達(dá)陽性或陰性的OPSCC患者其生存率存在顯著性差異，HPV陽性者預(yù)后好于HPV陰性者?；谶@些研究結(jié)果，AJCC第8版將HPV感染狀態(tài)已列入口咽癌分期中，HPV陽性者臨床分期明顯低于HPV陰性者[9-13]。關(guān)于HPV感染與OPSCC之間的關(guān)系，目前研究結(jié)果多來自美國及西方國家人群，國內(nèi)人群相關(guān)研究偏少。

本研究擬通過免疫組化技術(shù)檢測p16INK4A獲得OPSCC患者HPV感染率，根據(jù)感染狀態(tài)進(jìn)行分層分析，從而獲得p16INK4A陽性及陰性患者在流行病學(xué)、臨床特點、生存時間等方面是否存在顯著性差異，同時獲取HPV感染狀態(tài)、臨床因素如年齡、病理分級、治療方法等對患者生存期是否有顯著影響。通過本研究，有望為HPV相關(guān)性的OPSCC患者是否降低治療強(qiáng)度提供更直接有力的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集江西省腫瘤醫(yī)院2010年1月至2017年12月收治的58例OPSCC患者，男∶女比例為6.25∶1，年齡40～84歲，中位年齡60歲。所有患者均行病理活檢證實為口咽鱗狀細(xì)胞癌，所有病例均有病史資料及有效的石蠟標(biāo)本。所有標(biāo)本均行3 μm厚連續(xù)切片，分別行蘇木精-伊紅染色液(HE)染色和免疫組化檢測。收集所有患者臨床治療資料，如臨床分期、病理結(jié)果、治療方法及后續(xù)治療方法等。

1.2 方法與試劑

p16INK4A單克隆抗體購、乙二胺四乙酸EDTA修復(fù)液購自無錫傲銳東源生物科技有限公司，貨號為ZM-0205(小鼠抗人p16INK4A單克隆抗體，亞型IgG1；克隆號：1C1，DAB顯色劑、乙醇、二甲苯等其它試劑購于市售。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，常規(guī)梯度乙醇脫苯入水，PBS充分洗滌后置入乙二胺四乙酸EDTA(Ph 9.0)，于微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，加入100 μl的內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑(3%H2O2)處理，加p16INK4A單克隆抗體或空白對照試劑，滴加100 μl酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物，37 ℃孵育20 min，PBS緩沖液充分浸泡，加DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。用已知宮頸鱗癌p16陽性組織切片作為陽性對照，用已知宮頸p16陰性組織切片為陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷

隨機(jī)選擇5個高倍視野，計數(shù)500個以上細(xì)胞，以>70%的腫瘤細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)呈強(qiáng)而彌散染色(棕黃色)為陽性[14-18]，由病理科兩名高級醫(yī)生進(jìn)行閱片及評估結(jié)果。

1.4 治療方法

6例患者明確診斷后放棄治療，16例患者接受單純手術(shù)，2例手術(shù)加化療，2例手術(shù)加放療，2例手術(shù)加放化療綜合治療，5例單純放療，其中有1例因經(jīng)濟(jì)原因中斷放療；6例單純化療，19例根治性放療加化療。手術(shù)方式：采取經(jīng)下唇下頜正中裂開入路或經(jīng)口腔入路行原發(fā)病灶擴(kuò)大切除，術(shù)中經(jīng)冰凍病理檢查證實切緣陰性；手術(shù)缺損多采取皮瓣修復(fù)(包括胸大肌皮瓣、頦下島狀皮瓣及游離前臂皮瓣等)；頸部根據(jù)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況行淋巴結(jié)選擇性清掃術(shù)、 改良性清掃術(shù)或經(jīng)典性頸清掃術(shù)。無手術(shù)死亡病例。放療多采用調(diào)強(qiáng)放療技術(shù)，采用直線加速器，根治量為70 Gy，術(shù)后放療量為60～66 Gy，1例因經(jīng)濟(jì)困難中途終止治療，劑量為28 Gy；同期化療多使用順鉑(30 mg/m2)，每周1次，共5～7次，輔助性化療方案多使用紫杉醇類+鉑類。治療過程中給予支持對癥治療。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，總體生存率(overall survival，OS)為主要研究終點，以死亡為觀察終點。計數(shù)資料之間采用卡方檢驗，采用Kaplan-Meier生存分析法，采用Log-rank檢驗進(jìn)行單因素分析，采用Cox模型進(jìn)行多因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p16INK4A表達(dá)情況

本研究采用>70%的腫瘤細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)呈強(qiáng)而彌散染色(棕黃色)作為p16INK4A的陽性標(biāo)準(zhǔn)，58例患者中p16INK4A陽性率為24.1%(14/58)。

2.2 HPV相關(guān)口咽癌與非相關(guān)口咽癌流行病學(xué)及臨床病理特點

從表1中可以看出，HPV陽性與陰性組相比較，除在發(fā)病部位存在顯著性差異外(P=0.023)，在性別、吸煙、嗜酒、身體質(zhì)量指數(shù)(Body Mass Index,BMI)、病理分化、臨床分期方面、治療方式等方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 預(yù)后情況

隨訪至2019年9月30日，中位隨訪時間33個月(3.0～99.0個月)，隨訪率為100%。19例存活至今，其中6例患者出現(xiàn)原發(fā)灶復(fù)發(fā)，3例肺轉(zhuǎn)移，2例骨轉(zhuǎn)移，2例惡液質(zhì)。其余39例患者死亡，均為腫瘤原因?qū)е隆?/p>

根據(jù)Kaplan-Meier生存分析法統(tǒng)計分析，本研究中患者3年總體生存率為42.3%，HPV陽性組為47.6%，HPV陰性組為39.3%；HPV陽性患者與HPV陰性者在總體生存率不存在顯著性差異 (χ2=0.13，P=0.7190)，見圖1。

表1 不同HPV感染狀態(tài)口咽癌患者臨床因素比較(例，%)

圖1 不同HPV感染狀態(tài)OPSCC患者OS比較

2.4 生存預(yù)后影響因素分析

單因素分析性別、抽煙、飲酒、BMI、腫瘤部位、病理分化程度、分期(Ⅱ期，Ⅲ期，Ⅳ期)等臨床因素對總體生存率均無顯著影響，年齡(<60歲，≥60歲)、是否合并基礎(chǔ)疾病(如雙重癌，多重癌，高血壓，糖尿病)、是否接受根治性放療對總生存率有顯著影響，P值分別為0.002，0.034，0.016(表2)。 Cox模型分析上述相關(guān)因素，年齡(<60歲，≥60歲)、根治性放療對總體生存率均有顯著影響(表3)。

表2 單因素分析總生存率的影響因素

表3 多因素分析總生存率的影響因素

3 討論

近些年來多項研究證實口咽部鱗狀細(xì)胞癌(OPSCC)發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與HPV感染有著密切關(guān)系，同時發(fā)現(xiàn)HPV陽性者預(yù)后明顯好于陰性者，并證實HPV感染與否是OPSCC患者獨立預(yù)后因素，遂2018年AJCC第8版將HPV感染狀態(tài)納入臨床分期，如果T、N分期相同，HPV陽性者臨床分期明顯降低。但有學(xué)者認(rèn)為，根據(jù)HPV感染狀態(tài)調(diào)整治療方案可能存在陷阱，臨床治療需要慎重，因為HPV感染的檢測方法有多種，且診斷標(biāo)準(zhǔn)存在差異[19]。

檢測HPV感染的方法有免疫組化法(IHC)檢測p16，聚合酶鏈反應(yīng)法(PCR)、原位雜交法(ISH)檢測HPV DNA ，ISH檢測HPV RNA及逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)法(RT PCR)檢測HPVE6/E7mRNA，后者為診斷HPV感染的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但對實驗室要求很高，費用昂貴，診斷結(jié)果重復(fù)性差，臨床上很少用[20]。

基于前期研究證實p16INK4A-IHC與HPV DNA和RNA(致癌基因E6和E7 mRNA)之間具有強(qiáng)相關(guān)性，AJCC第8版規(guī)定p16INK4A(IHC)被推薦用于口咽癌患者檢測HPV感染的常用方法。p16INK4A-IHC操作簡單，易重復(fù)，已廣泛應(yīng)用臨床。

本研究采用IHC檢測p16INK4A，采用>70%的腫瘤細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)呈強(qiáng)而彌散染色(棕黃色)為HPV感染的陽性標(biāo)準(zhǔn)。本研究發(fā)現(xiàn)58例患者HPV感染率24.1%(14/58)，明顯低于歐美國家報道(50%～70%)[2-8]，可能存在種族差異、生活習(xí)慣等方面的原因。本研究發(fā)現(xiàn)HPV陽性者與陰性者在生存期存在差異，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義，亦未發(fā)現(xiàn)吸煙及飲酒史對生存期有顯著性影響，與大部分研究對象無吸煙及飲酒史可能有關(guān)。

通過單因素分析發(fā)現(xiàn)年齡(<60歲，≥60歲)、是否合并基礎(chǔ)疾病(如雙重癌，多重癌，高血壓，糖尿病)及是否接受根治性放療對總生存率有顯著影響。通過多因素分析，年齡(<60歲，≥60歲)、接受根治性放療對總體生存率均有顯著影響，與既往報道相類似[21-22]。

本研究缺陷為回顧性研究，樣本量有限，研究對象局限，僅對在我院有效病理蠟塊的患者進(jìn)行研究總結(jié)，而我院OPSCC中有一大部分患者病理資料來自于外院或病理組織抗原丟失，無法進(jìn)行檢測。因經(jīng)濟(jì)條件有限、病情晚期放棄治療等原因，很大一部分患者未接受規(guī)范化治療，故患者治療方面存在很大異質(zhì)性。因此前瞻性研究，加大研究的樣本量，檢測HPV感染狀態(tài)與OPSCC進(jìn)行相關(guān)性研究，更能準(zhǔn)確地反映OPSCC患者HPV感染狀況及其對預(yù)后的影響。

通過本項研究顯示OPSCC患者中存在HPV感染率24.1%(n=14)，HPV陽性與陰性患者總生存率沒有顯著性差異，但患者年齡、是否接受根治性放療對總生存率有顯著性影響。