王德前，陸建強，董捷，黃敏婕

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所， 浙江 杭州 310021； 2.建德市建珂養(yǎng)殖有限公司，浙江 杭州 311612)

浙江省蛋雞養(yǎng)殖規(guī)模化、集約化程度不斷提高，養(yǎng)殖場多采用高密度飼養(yǎng)模式與高強度生產(chǎn)方式，加上夏季高溫高濕等極端天氣頻發(fā)，蛋雞熱應激防控已成為困擾蛋雞養(yǎng)殖場的重要難題。蛋雞適宜飼養(yǎng)溫度為15 ℃～25 ℃，超過該范圍容易引發(fā)蛋雞應激反應，導致機體糖、蛋白質(zhì)、脂肪和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)代謝紊亂，輕則引起采食量、產(chǎn)蛋率和雞蛋品質(zhì)下降，重則直接導致蛋雞死亡，嚴重影響我省夏季蛋雞安全生產(chǎn)。

發(fā)生熱應激反應時，機體細胞大量表達熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)。HSPs作為一類多肽類蛋白，廣泛存在于原核和真核生物細胞內(nèi)，對維持細胞結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用。HSP70是熱休克蛋白家族中最具代表性、分布最廣的蛋白成員，具有分子伴侶、協(xié)同免疫、維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等功能[1]。HSP70表達水平與溫度變化緊密相關(guān)，對生物的熱耐受性有著重要影響。正常情況下機體中HSP70低水平表達，熱應激條件下HSP70大量表達，行使分子伴侶功能，通過協(xié)助維持蛋白結(jié)構(gòu)、修復變性蛋白、阻止細胞內(nèi)變性蛋白蓄積等方式保護細胞免受損傷[2]。此外，HSP70還通過介入細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達，直接參與細胞凋亡過程[3]。熱應激可促進HSP70進入H9C2心肌細胞核。HSP70表達抑制后，HSP70蛋白入核顯著降低，促進細胞凋亡[4]。采用RNA干涉調(diào)低人胃癌細胞HSP70表達水平，抑制腫瘤細胞生長，促進細胞凋亡發(fā)生[5]。HSP70過表達抑制具有促進細胞死亡功能的基質(zhì)金屬蛋白酶活性，保護細胞免受熱應激損傷[6]。

本研究采用qRT-PCR方法監(jiān)測不同溫度條件下蛋雞心臟和肝臟組織中HSP70表達，以及肝臟組織中細胞色素C氧化酶(CCO)、腫瘤壞死因子凋亡誘導因子配體(TRAIL)、應激活化蛋白激酶(SAPK)和蛋白激酶(PKB)等細胞凋亡信號通道關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平差異，探討HSP70對蛋雞熱耐受性與細胞凋亡的影響，進一步明確蛋雞熱應激發(fā)生機理，便于精準采取有效措施進行蛋雞熱應激防控。

1 材料與方法

1.1 處理設(shè)計

90只170日齡伊莎蛋雞進行2周適應性飼養(yǎng)，平均分為對照組(25 ℃常溫飼養(yǎng))、實驗組Ⅰ(30 ℃熱應激處理)和實驗組Ⅱ(35 ℃熱應激處理)，每組30只(每組3個重復，每個重復10只)，試驗期1周。無菌采集心臟、肝臟組織樣本，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 樣品檢測

1.2.1 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

取2～3 g組織樣本于液氮中研磨至粉末狀，稱取200 mg粉末，使用Trizol試劑盒提取總RNA，1%甲醛變性瓊脂糖電泳檢測提取的總RNA質(zhì)量，紫外分光光度計測定總RNA含量，稀釋至100 ng·μL-1，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計

參照禽類HSP70、CCO、TRAIL、SAPK和PKB基因序列，Primer 6.0設(shè)計熒光定量PCR引物，內(nèi)參基因采用雞β-actin，引物由Invitrogen(上海)貿(mào)易有限公司合成。引物序列見表1。

表1 各基因的引物序列

1.2.3 反應體系與程序

qRT-PCR反應體系為20 μL：2×SYRB Premix Ex Taq 10.0 μL，上、下游引物各1 μL， cDNA 2.0 μL、ddH2O 6.0 μL。反應程序：95 ℃預變性35 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸35 s，35個循環(huán)。溶解曲線：60 ℃升溫至95 ℃ 15 s，60 ℃保溫1 min，95 ℃保溫20 s。

1.3 統(tǒng)計分析

利用2-ΔΔCt法對熒光定量PCR數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，運用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用獨立樣本T檢驗進行不同處理組間比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋雞心臟和肝臟組織HSP70表達情況

蛋雞心臟和肝臟組織HSP70表達量均隨溫度升高而逐步增加。實驗組Ⅱ蛋雞心臟組織HSP70表達量最高(P<0.01)，25 ℃常溫對照組和30 ℃熱應激處理間HSP70表達差異不顯著。各處理組蛋雞肝臟組織HSP70相對表達量差異顯著，30 ℃熱應激處理組顯著高于25 ℃常溫對照組，35 ℃熱應激處理組極顯著高于25 ℃常溫對照組和30 ℃熱應激處理組(圖1)。

*—差異顯著(P<0.05)；**—差異極顯著(P<0.01)。圖2同。圖1 熱應激對蛋雞心臟和肝臟HSP70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平影響

2.2 蛋雞肝臟組織細胞凋亡相關(guān)基因表達情況

與正常對照組相比，蛋雞30 ℃熱應激處理后的肝臟組織細胞色素C氧化酶(CCO)、腫瘤壞死因子凋亡誘導因子配體(TRAIL)和應激活化蛋白激酶(SAPK)基因相對表達量變化不顯著，35 ℃熱應激處理使肝臟組織CCO、TRAIL、SAPK表達量極顯著降低；蛋白激酶(PKB)表達量極顯著升高。35 ℃熱應激處理后，蛋雞肝臟PKB表達極顯著高于30 ℃熱應激處理組和25 ℃正常對照組(圖2)。

圖2 蛋雞肝臟細胞凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平

3 討論

HSP70廣泛參與各種維持和保護細胞功能，增強機體對應激的耐受能力，提高細胞存活率，是一種重要的細胞質(zhì)分子伴侶保護蛋白[7]。急性和慢性熱應激均能上調(diào)蛋雞心臟和肝臟組織HSP70 mRNA表達水平[8]，熱應激能提升雞肝臟基因表達譜中HSP70基因表達豐度[9]，急性噪聲應激導致肉鴨心臟和肝臟HSP70、HSP90表達量升高，緩解熱應激引起的細胞損害[2]。本研究中，蛋雞心臟和肝臟組織熱休克蛋白的表達情況同上述研究結(jié)果基本一致。心臟和肝臟組織HSP70 mRNA相對表達量隨著溫度升高而增加，熱休克蛋白表達量和溫度呈一定程度正相關(guān)。在正常飼養(yǎng)條件下，肝臟HSP70 mRNA表達量是心臟的3.39倍，熱應激后2種組織HSP70 mRNA表達量相差2.87倍。HSP70高表達有利于蛋白質(zhì)維持正常構(gòu)象，保持細胞功能，提高對外界不良刺激的抵抗能力[9]。

細胞凋亡受到促凋亡信號通路與抗凋亡信號通路的雙重調(diào)控。細胞促凋亡信號通路分為由線粒體介導的內(nèi)源性細胞凋亡信號通路和由死亡受體介導的外源細胞凋亡信號通路[10]。細胞色素C氧化酶基因、腫瘤壞死因子凋亡誘導因子配體分別為線粒體介導與死亡受體介導的促凋亡信號通路關(guān)鍵基因，應激活化蛋白激酶基因在細胞促凋亡信號通路上游基因，這3個基因的高表達都有促進細胞凋亡的功能。本研究中，隨著溫度升高，肝臟細胞中HSP70高表達，導致CCO、TRAIL和SAPK基因表達水平顯著下降，抑制細胞凋亡。過量HSP70與Bax結(jié)合，導致遷移至線粒體的Bax減少，抑制了細胞色素C的釋放，引起下游半胱氨酸蛋白酶(Caspase)失活，通過線粒體介導的內(nèi)源性細胞凋亡信號通路抑制細胞凋亡[11]。HSP70蛋白過表達，與TRAIL競爭性結(jié)合成TRAIL-R1，導致死亡信號復合體解離，抑制Caspase-8活性，通過死亡受體介導的外源細胞凋亡信號通路抑制細胞凋亡[12]。HSP70還通過抑制應激活化蛋白激酶表達，在細胞促凋亡信號通路上游發(fā)揮作用抑制細胞凋亡[13]。HSP70作為多種激酶分子伴侶，與PKB及伴侶分子Cdc37形成復合體，活化PKB功能，通過抑制細胞抗凋亡信號通路保護細胞免受損傷[14]。綜上所述，高溫環(huán)境能引起蛋雞心臟和肝臟組織HSP70過量表達，影響CCO、TRAIL等細胞凋亡信號通路關(guān)鍵基因的表達水平，調(diào)節(jié)細胞凋亡過程，對蛋雞機體細胞功能有重要作用，嚴重影響蛋雞生產(chǎn)性能。保持適宜飼養(yǎng)溫度對維持蛋雞組織細胞結(jié)構(gòu)和功能，保持高產(chǎn)性能具有重要的作用，為在生產(chǎn)中采取精準措施防控熱應激、保障動物福利提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。