玻璃化冷凍對家畜卵母細胞細胞生物學性狀影響的研究進展

王晶晶，郝海生，杜衛(wèi)華，劉 巖，龐云渭，趙善江，閆長亮，趙學明*，朱化彬

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，家畜胚胎工程與繁殖創(chuàng)新團隊，北京 100193；2.中國牧工商（集團）總公司，北京 100070）

1977 年Whittingham[1]第1 次通過慢速冷凍法冷凍小鼠卵母細胞并解凍后成功產(chǎn)下子代，引起世界關(guān)注。Rall 首次發(fā)明了玻璃化冷凍法，該方法是通過在冷凍過程中使胞質(zhì)溶液的黏度隨溫度降低而增加，形成無規(guī)則的玻璃化固體，通過減少冰晶形成而降低細胞損傷[2]。相較于慢速冷凍法，玻璃化冷凍法操作簡便、成本低、傷害更低、效果更優(yōu)[3]。卵母細胞玻璃化冷凍保存形成的卵子庫消除了時間空間的差異[4]，保存生育力尤其是可能失去生育能力的婦女，并且避免了冷凍胚胎產(chǎn)生的宗教、道德、法律問題[5]，對家畜胚胎生物技術(shù)和人類輔助生殖都具有十分重要的意義。在小鼠卵母細胞玻璃化冷凍取得成功后，隨后在猴子[6]、人[7]、兔[8]、牛[9]、馬[10]等各種哺乳動物的玻璃化冷凍卵母細胞也取得成功。

雖然玻璃化冷凍卵母細胞有很多優(yōu)良特性和便利條件，但仍與新鮮卵母細胞的發(fā)育潛力有很大差距。玻璃化冷凍的卵母細胞發(fā)育潛力降低，仍存在受精率、卵裂率、囊胚率較低等問題[11]。本文通過闡述玻璃化冷凍對卵母細胞造成的傷害，進一步了解玻璃化冷凍卵母細胞的變化，從而為改善玻璃化冷凍卵母細胞的質(zhì)量提供思路。

1 玻璃化冷凍對卵母細胞細胞結(jié)構(gòu)的影響

1.1 細胞核

1.1.1 GV 期卵母細胞和MII 期卵母細胞 玻璃化冷凍會導致小鼠GV 期卵母細胞核無秩序、不成熟的染色體壓縮、核質(zhì)的混合及卵母細胞核恢復(fù)之后細胞核碎片進入細胞質(zhì)的具象化[12]，這可能不利于卵受精后的發(fā)育[12]（表1）。玻璃化冷凍小鼠GV 期卵母細胞體外成熟（IVM）后，姐妹染色體著絲點間的距離和非整倍體率高于對照組[13]；且玻璃化冷凍豬卵母細胞會有GV 期過早結(jié)束以及減數(shù)分裂異?，F(xiàn)象的產(chǎn)生[14]。除此之外，玻璃化冷凍會使人卵母細胞染色體結(jié)構(gòu)損壞顯著升高[15]和牛卵母細胞DNA 碎片水平增加[16]。玻璃化冷凍不同時期的卵母細胞會對細胞核產(chǎn)生不同的影響。玻璃化冷凍GV 期卵母細胞會導致細胞核混亂及染色體異倍性增加，這可能與黏著素復(fù)合物的形成降低從而破壞了著絲粒的黏著性有關(guān)[13]。而玻璃化冷凍MII 期卵母細胞異倍性的狀況優(yōu)于GV 期，MII 期卵母細胞可能是避免非整倍體冷凍保存的理想選擇[13]。玻璃化冷凍會造成水牛卵母細胞染色體排列異常[4]、小鼠卵母細胞染色體從赤道區(qū)域的偏離等[17]?？梢姡ＡЩ鋬龅腗II 期卵母細胞易產(chǎn)生染色體位置異常。

1.1.2 卵丘卵母細胞復(fù)合體（COCs） 牛[18]、羊[19]COCs 玻璃化冷凍后體外成熟（IVM）培養(yǎng) 24 h，卵母細胞細胞核成熟率顯著降低，細胞骨架的解散可能是導致這一現(xiàn)象的原因[18]。玻璃化冷凍COCs 卵母細胞會不利于細胞核的成熟。卵丘細胞有利于細胞核的成熟，而暴露于抗凍保護劑會使卵丘細胞通過其與卵母細胞建立物理接觸的跨區(qū)域投射內(nèi)的肌動蛋白絲失去秩序[20]，這可能是核成熟率降低的原因。

1.2 細胞器 玻璃化冷凍對細胞核細胞質(zhì)造成損傷的同時也會對卵母細胞細胞器造成較大傷害，包括細胞器的分布、結(jié)構(gòu)和功能，這些傷害導致玻璃化冷凍的卵母細胞發(fā)育能力降低。

1.2.1 線粒體 玻璃化冷凍會破壞狐貍[21]和豬[22]卵母細胞線粒體正常分布及線粒體超微結(jié)構(gòu)完整性[22]。在人上，玻璃化冷凍還會減少線粒體平滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集[23]（表1）。研究表明，玻璃化冷凍會導致豬[22]、人[24]和牛[16]卵母細胞線粒體膜電位ΔΨm 顯著降低，而ΔΨ 顯著降低會誘發(fā)線粒體磷酸轉(zhuǎn)運體和線粒體膜破裂導致凋亡蛋白等釋放到膜間隙[16]。

1.2.2 紡錘體 紡錘體是檢測冷凍損傷的靈敏指標之一，它對溫度降低特別敏感，且研究證實有紡錘體的卵母細胞胚胎發(fā)育潛能較高[25]。研究表明，玻璃化冷凍人GV期卵母細胞在體外成熟至MII 期后會產(chǎn)生紡錘體結(jié)構(gòu)損壞的現(xiàn)象[15]，同時玻璃化冷凍也會引起小鼠卵母細胞紡錘體紊亂和消失[26]以及豬卵母細胞紡錘體嚴重損傷[27]，這些異常都會導致體外受精后未分裂或染色體分裂異常，從而造成非整倍體形成（表1）。

1.2.3 微管、微絲、微絨毛 玻璃化冷凍會導致卵母細胞微絲網(wǎng)絡(luò)的混亂[4]，而微絲和微管組織的變化會損害卵母細胞的發(fā)育能力[19]。Palmerini 等[23]研究表明，玻璃化冷凍會造成人GV 期卵母細胞40% 微絨毛超微結(jié)構(gòu)異常、MII 期卵母細胞30%微絨毛超微結(jié)構(gòu)異常。

1.2.4 皮質(zhì)顆粒（CG） CG 分布和遷移的變化已成為卵母細胞成熟過程中評價胞質(zhì)成熟的重要指標之一[28]。CG 分布混亂和功能異常對卵母細胞發(fā)育及受精產(chǎn)生不利影響，從而影響胚胎質(zhì)量[28]。Palmerini 等[23]研究玻璃化冷凍人卵母細胞發(fā)現(xiàn)CG 在分布和基質(zhì)電子密度上呈現(xiàn)異常；Wu 等[29]研究證明，玻璃化冷凍牛卵母細胞會出現(xiàn)CG 缺失（表1）。

1.3 細胞質(zhì) 研究表明，玻璃化冷凍會對細胞質(zhì)產(chǎn)生較大的傷害，包括核質(zhì)混亂、細胞質(zhì)成分GV 期前的破裂以及細胞質(zhì)的無秩序[12]。脂質(zhì)是細胞中最豐富、最重要的成分之一，其中胞質(zhì)脂滴在細胞能量中起重要作用[30]。

冷凍保存會對卵母細胞造成滲透和冷凍損傷，導致其脂代謝和氧環(huán)境異常，從而影響其發(fā)育能力[19]。同時，在冷凍保存過程中，脂質(zhì)相分離后相變是導致富含脂質(zhì)卵母細胞冷凍損傷的主要原因之一[30]。另外，冷凍導致牛卵母細胞質(zhì)內(nèi)油脂含量增高[31]、脂滴形成[32]、脂質(zhì)結(jié)構(gòu)變化[32]等，同樣會造成小鼠卵母細胞磷脂分布和表達量顯著變化[33]（表1）。

表1 玻璃化冷凍對卵母細胞造成的傷害

2 玻璃化冷凍對卵母細胞重要蛋白和分子的影響

2.1 細胞重要蛋白

2.1.1 凋亡蛋白 細胞凋亡是降低哺乳動物卵母細胞發(fā)育潛能的主要因素之一[34]，而半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）家族在該過程中起關(guān)鍵作用。研究表明，Caspase 8[35]、Caspase 9[36]分別在死亡受體-介導的外源性凋亡通路和線粒體-介導的內(nèi)源性凋亡通路中起到關(guān)鍵作用。有研究表明，玻璃化冷凍導致牛卵母細胞ΔΨm 降低，進而促進磷脂酰絲氨酸（PS）外翻，并且激活caspase-3 蛋白表達，而caspase-3 蛋白的超表達會使DNA 碎片顯著增加[16]。冷凍還會導致牛卵母細胞中caspase 8 和caspase 9 的表達增加[37]。

2.1.2 黏連蛋白 姐妹間著絲點距離與著絲粒內(nèi)聚力有關(guān)，而絲粒內(nèi)聚力與黏著素復(fù)合物的形成有關(guān)。有實驗證明，玻璃化冷凍小鼠卵母細胞導致3 個黏連蛋白（SMC1β、STAG3、SMC3）的相對表達顯著減少[13]，可以表明玻璃化冷凍通過影響?zhàn)ぶ貜?fù)合物的形成而破壞著絲粒的黏著性，進一步影響卵母細胞的非整倍性，使得其非整倍性增高。自噬被廣泛認為是由各種環(huán)境和細胞壓力引起的生存或反應(yīng)機制。玻璃化冷凍小鼠卵母細胞的自嗜蛋白BECLIN1 表達增加[38]，這勢必會影響卵母細胞進一步發(fā)育潛力。

2.2 細胞重要分子

2.2.1 腺嘌呤核苷三磷酸（ATP） 玻璃化解凍牛[39]、人[40]卵母細胞ATP 含量和ATP 合酶活性顯著降低，這可能是由于其FAD/ NAD（P）H（黃素腺嘌呤二核苷酸/煙酰胺型輔酶）比率顯著升高造成的[40]。

對ATP 來說，線粒體Ca2+是控制ATP 生產(chǎn)速度的一個重要組件，它控制線粒體通透性轉(zhuǎn)換的發(fā)生，而這在細胞凋亡線粒體控制過程中發(fā)揮作用。大量Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)涌入細胞質(zhì)，進而促進Ca2+涌入到線粒體[16]。Ca2+的涌入可以刺激線粒體新陳代謝和隨后ROS 的生成增加，啟動一系列事件導致氧化應(yīng)激，從而增加Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）釋放的可能性，這可能與玻璃化冷凍卵母細胞中ATP 的變化有關(guān)[16]。

2.2.2 ROS 玻璃化冷凍卵母細胞ROS 水平會顯著升高，主要有2 個原因：①卵母細胞的脂質(zhì)會產(chǎn)生大量ROS，從而影響氧化還原反應(yīng)和細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)之間的平衡[41]；②線粒體損傷也會造成生產(chǎn)和清除ROS 間的失衡，導致凈ROS 產(chǎn)生進而會加劇線粒體功能障礙，使ROS 的產(chǎn)量更高[17]。

高水平ROS 不僅會引起DNA 損傷、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和蛋白質(zhì)氧化反應(yīng)[42]，還能引起卵母細胞發(fā)育潛能降低[39]，從而對胚胎發(fā)育產(chǎn)生不利影響[43]。

2.2.3 Ca2+玻璃化冷凍會引起胞內(nèi)Ca2+濃度升高，提前激活卵母細胞，使CG 提前釋放，從而導致透明帶硬化，影響受精效果[42]。有研究進一步表明，玻璃化冷凍會促使牛卵母細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放到細胞質(zhì)中，提高胞內(nèi)Ca2+和線粒體Ca2+水平，進而促進CG 提前釋放以及線粒體功能異常[17]。因為線粒體依賴于Ca2+信號來實現(xiàn)自身功能，尤其是其產(chǎn)生ATP 的能力，Ca2+超載可能解釋玻璃化卵母細胞中ΔΨm 的下降，而線粒體中ΔΨm 降低導致卵母細胞減數(shù)分裂裝置異常，導致胚胎出現(xiàn)鑲嵌混亂[16]。

2.2.4 谷胱甘肽（GSH） GSH 是一種重要的細胞內(nèi)硫醇化合物，在細胞增殖、氨基酸轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)和DNA合成以及氧化還原狀態(tài)維持、清除細胞氧自由基[44]等諸多生物學功能中發(fā)揮重要作用[45]。在卵母細胞成熟過程中，GSH 的合成是精子染色質(zhì)去致密化和雄性原核形成的前提[46]。研究表明，小鼠[47]、山羊[48]、牛[49]、豬[50]、犬[51]卵母細胞、銀狐COCs 經(jīng)玻璃化冷凍解凍、IVM 72 h 后，細胞中GSH 含量顯著降低，而冷凍保護劑處理組與新鮮組之間GSH 含量無顯著差異[21]。而成熟卵母細胞GSH 含量降低與胚胎發(fā)育能力差有關(guān)[45]。

3 展 望

相較于慢速冷凍法，玻璃化冷凍保存有諸多優(yōu)勢。玻璃化冷凍的卵母細胞解凍體外培養(yǎng)體外受精后卵裂率、囊胚率更高，胚胎移植后妊娠率更高和流產(chǎn)率較低。但玻璃化冷凍保存仍然會對卵母細胞造成不可忽視的損傷，包括細胞核、細胞質(zhì)、細胞器等方面的變化，從而降低卵母細胞的發(fā)育潛力，最終影響胚胎質(zhì)量。因此，如何緩解卵母細胞在玻璃化冷凍過程中受到的損傷，是促進該技術(shù)進一步發(fā)展的關(guān)鍵，也是未來該領(lǐng)域研究的趨勢，如完善抗凍保護劑、進一步提升玻璃化冷凍解凍程序以及解凍后卵的恢復(fù)。