韓耀倫 王 璐 馬 欣

(河南省人民醫(yī)院口腔科,鄭州 450000)

牙髓炎是常見的口腔疾病，如果不能得到積極的治療可引起牙根尖周組織炎癥、咀嚼障礙、牙列缺損等；牙髓炎最重要的致病因素為微生物感染，脂多糖是牙髓炎的主要毒力因子，容易引起牙髓組織的炎癥反應(yīng)，因此降解脂多糖、抑菌等消除感染因素在治療牙髓炎中具有重要意義[1，2]。蓋髓劑在牙髓的保存治療中發(fā)揮重要作用，目前使用的蓋髓劑不能降解脂多糖等毒性產(chǎn)物、不能抗炎抑菌，因此不能從根本上保護(hù)牙髓細(xì)胞。黃芩苷具有抗炎、抑菌、降解脂多糖等作用[3，4]，研究發(fā)現(xiàn)用黃芩苷糊劑蓋髓治療犬實(shí)驗(yàn)性牙髓炎的效果優(yōu)于Dycal的蓋髓效果[5]。但黃芩苷抑制牙髓炎癥的機(jī)制尚不十分清楚，研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路在多種疾病中發(fā)揮作用[6]。本文通過對(duì)黃芩苷對(duì)大鼠牙髓細(xì)胞的保護(hù)作用及對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響進(jìn)行研究，探討黃芩苷是否通過TLR4/NF-κB通路抑制牙髓炎的炎癥反應(yīng)從而發(fā)揮保護(hù)牙髓細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康、清潔級(jí)、8周齡、雌雄各半、體重240～290 g、SD大鼠36只購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，許可證號(hào)：SYXK(京)2014-0032。

1.1.2主要試劑和儀器 黃芩苷(中國(guó)藥品生物制品鑒定所)，玻璃離子液劑和粉劑(美國(guó)3M公司)，RIPA裂解液、氯仿、異丙醇、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(美國(guó)Sigma公司)，RT-PCR試劑盒、ELISA試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，TLR4抗體、NF-κB抗體(美國(guó)Abcam公司)，高速離心機(jī)(日本NSK公司)，7500熒光定量PCR儀(美國(guó)LIGHT ABI公司)。

1.1.3黃芩苷糊劑[5]將黃芩苷和生理鹽水調(diào)和成稠糊狀。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將36只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組、牙髓炎組和黃芩苷組，每組12只。每只大鼠選擇左上頜和右上頜第一、第二磨牙進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組共48只實(shí)驗(yàn)牙。

1.2.2大鼠模型建立及處理[7]將36只大鼠麻醉成功后仰臥固定，乙醇消毒實(shí)驗(yàn)牙，在噴水冷卻下鉆磨實(shí)驗(yàn)牙中央窩，鉆至深層牙本質(zhì)近髓透紅，用擴(kuò)孔銼捅開牙髓腔，用探針將開髓孔擴(kuò)大至直徑0.5 mm，無(wú)菌生理鹽水沖洗，棉球止血、擦干。將含1 μl大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)脂多糖(濃度5 g/L)的棉捻放置開髓孔處30 min，然后用生理鹽水沖洗、擦干，黃芩苷組放置黃芩苷糊劑蓋髓，牙髓炎組不放蓋髓材料，然后用玻璃離子水門汀封洞。對(duì)照組大鼠不做任何干預(yù)。

1.2.3標(biāo)本采集 術(shù)后7 d，全麻成功后脫頸處死大鼠，獲取大鼠上頜骨和牙齒標(biāo)本，每只大鼠取1只實(shí)驗(yàn)牙用于牙髓組織HE染色，1只實(shí)驗(yàn)牙用于牙髓組織中TNF-α、IL-6含量測(cè)定，1只實(shí)驗(yàn)牙用于牙髓組織中TLR4和NF-κB mRNA水平測(cè)定，1只實(shí)驗(yàn)牙用于牙髓組織中TLR4和NF-κB蛋白水平測(cè)定。

1.2.4牙髓組織HE染色 將大鼠的上頜骨及牙齒標(biāo)本用甲醛固定48 h，乙二胺四乙酸二鈉脫鈣1個(gè)月，酒精梯度脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察牙髓染色情況。并對(duì)牙髓炎組和黃芩苷組的牙髓組織進(jìn)行病理學(xué)評(píng)價(jià)[8]，組織紊亂程度分為0～3級(jí)：正常組織為0級(jí)，中心牙髓組織正常、成牙本質(zhì)細(xì)胞層紊亂為1級(jí)，全部牙髓組織失去正常形態(tài)為2級(jí)，牙髓壞死為3級(jí)。細(xì)胞炎癥反應(yīng)分為0～3級(jí)：開髓孔對(duì)應(yīng)牙髓組織中僅有個(gè)別或無(wú)炎癥細(xì)胞為0級(jí)，輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為1級(jí)，中度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為2級(jí)，重度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或形成膿腫為3級(jí)。硬組織形成分0～3級(jí)：無(wú)硬組織形成為0級(jí)，穿髓孔下少量硬組織形成為1級(jí)，穿髓孔下中等量硬組織形成為2級(jí)，穿髓孔下大量硬組織形成為3級(jí)。

1.2.5牙髓組織中TNF-α、IL-6含量測(cè)定 收集大鼠牙髓組織標(biāo)本，采用ELISA法測(cè)定牙髓組織中TNF-α、IL-6含量：在常溫下將凍干標(biāo)準(zhǔn)品瓶中加入離子水將TNF-α、IL-6濃度調(diào)為250 pg/ml，靜置15 min，把TNF-α、IL-6全部溶解，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍比梯度稀釋溶液依次加入檢測(cè)孔中(標(biāo)準(zhǔn)品稀釋濃度從 0～250 pg/ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線取7個(gè)點(diǎn))。計(jì)算一次實(shí)驗(yàn)需要的板條數(shù)，將全部板條取出放在框架內(nèi)，將標(biāo)本和不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入到相應(yīng)孔中，用封板膠紙封住反應(yīng)孔孵育120 min，加入洗滌液洗板5次，加入生物素化抗體工作液孵育60 min，洗板5次，加入酶結(jié)合物工作液孵育20 min，洗板5次，加入顯色劑TMB孵育20 min，加入終止液，使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度吸光度值為坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品TNF-α、IL-6濃度。

1.2.6牙髓組織中TLR4和NF-κB mRNA水平測(cè)定 小心剝離大鼠磨牙，取出牙髓組織標(biāo)本，用勻漿器進(jìn)行研磨，加入Trizol提取牙髓組織總RNA，將牙髓RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-PCR測(cè)定牙髓組織中TLR4和NF-κB mRNA水平，PCR反應(yīng)條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s、58℃ 1 min、72℃ 30 s，共38個(gè)循環(huán)，72℃ 1 min。以2-ΔΔCt表示牙髓組織中TLR4和NF-κB mRNA水平。TLR4引物序列：上游引物：5′-GGCATGATGTTGATTCTCGTTG-3′，下游引物：5′-AGCATTCTGGTCCGACTGC-3′。NF-κB引物序列：上游引物：5′-CTGAAGGACCGCGATACGTCT-3′，下游引物：5′-GAGAAGTGGATCTGCCGAAT-3′。

1.2.7牙髓組織中TLR4和NF-κB蛋白水平測(cè)定 小心剝離大鼠磨牙，取出牙髓組織標(biāo)本，用勻漿器進(jìn)行研磨，加入RIPA裂解液提取牙髓組織總蛋白，用BCA法測(cè)定牙髓總蛋白濃度，采用Western blot法測(cè)定牙髓組織中TLR4和NF-κB蛋白水平。進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗(TLR4抗體為1∶100，NF-κB抗體為1∶100)，過夜孵育，以β-actin為內(nèi)參照，加入二抗，孵育1 h。用Odyssey成像儀成像，以Image J分析蛋白的灰度值。TLR4和NF-κB蛋白水平以TLR4和NF-κB蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

2 結(jié)果

2.1三組大鼠牙髓組織HE染色 對(duì)照組大鼠牙髓組織正常：成牙本質(zhì)層細(xì)胞排列整齊，無(wú)血管擴(kuò)張充血，無(wú)明顯中性多核細(xì)胞浸潤(rùn)。牙髓炎組大鼠牙髓組織中成牙本質(zhì)細(xì)胞排列明顯紊亂，血管擴(kuò)張充血明顯，見大量中性多核白細(xì)胞浸潤(rùn)，表明牙髓炎模型建立成功。黃芩苷組大鼠牙髓組織中成牙本質(zhì)細(xì)胞排列紊亂、血管擴(kuò)張充血、中性多核白細(xì)胞浸潤(rùn)程度均較牙髓炎組輕，介于牙髓炎組和對(duì)照組之間。見圖1。

2.2牙髓炎組和黃芩苷組大鼠牙髓組織病理學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)比較 黃芩苷組大鼠牙髓組織紊亂分級(jí)和細(xì)胞炎癥反應(yīng)分級(jí)均低于牙髓炎組(P<0.05)，硬組織形成分級(jí)與牙髓炎組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 牙髓炎組和黃芩苷組大鼠牙髓組織病理學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)比較

Tab.1 Comparison of pathological evaluation indexes of pulp tissue in rats in pulpitis group and baicalin group

GroupsnTissue disorderclassification (grade)Cytoinflammatory responseclassification (grade)Hard tissue formationclassification (grade)Pulpitis group122.13±0.542.46±0.470.97±0.31Baicalin group121.24±0.431.08±0.360.89±0.28t4.4668.0750.663P0.0000.0000.514

2.3三組牙髓組織中TNF-α、IL-6含量比較 與對(duì)照組比較，牙髓炎組和黃芩苷組牙髓組織中TNF-α、IL-6含量升高(P<0.05)，與牙髓炎組比較，黃芩苷組牙髓組織中TNF-α、IL-6含量降低(P<0.05)。見表2。

表2 三組牙髓組織中TNF-α、IL-6含量比較

Tab.2 Comparison of TNF-α and IL-6 levels in pulp tissue of three groups

GroupsnTNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)Control group124.87±2.135.41±2.24Pulpitis group1234.52±2.641)29.85±2.731)Baicalin group1215.36±2.431)2)13.97±2.511)2)F467.372294.960P0.0000.000

Note：Compared with control group，1)P<0.05；compared with pulpitis group，2)P<0.05.

2.4三組牙髓組織中TLR4和NF-κB mRNA水平比較 與對(duì)照組比較，牙髓炎組和黃芩苷組牙髓組織中TLR4和NF-κB mRNA水平升高(P<0.05)，與牙髓炎組比較，黃芩苷組牙髓組織中TLR4和NF-κB mRNA水平降低(P<0.05)。見表3。

圖1 三組大鼠牙髓組織HE染色(×100)Fig.1 HE staining of rat dental pulp tissue of three groups (×100)

表3 三組牙髓組織中TLR4和NF-κB mRNA水平比較

Tab.3 Comparison of TLR4 and NF-κB mRNA levels in pulp tissue of three groups

GroupsnTLR4 mRNANF-κB mRNAControl group121.00±0.091.00±0.08Pulpitis group123.14±0.131)3.42±0.141)Baicalin group122.23±0.121)2)2.53±0.111)2)F1 053.8981 415.654P0.0000.000

Note：Compared with control group，1)P<0.05；compared with pulpitis group，2)P<0.05.

表4 三組牙髓組織中TLR4和NF-κB蛋白水平比較

Tab.4 Comparison of TLR4 and NF-κB protein levels in pulp tissue of three groups

GroupsnTLR4 proteinNF-κB proteinControl group120.17±0.080.14±0.09Pulpitis group120.39±0.131)0.93±0.161)Baicalin group120.26±0.111)2)0.47±0.141)2)F12.441106.334P0.0000.000

Note：Compared with control group，1)P<0.05；compared with pulpitis group，2)P<0.05.

圖2 三組牙髓組織中TLR4和NF-κB蛋白Western blot電泳圖Fig.2 Western blot analysis of TLR4 and NF-κB proteins in pulp tissue of three groupsNote:A.Control group；B.Pulpitis group；C.Baicalin group.

2.5三組牙髓組織中TLR4和NF-κB蛋白水平比較 與對(duì)照組比較，牙髓炎組和黃芩苷組牙髓組織中TLR4和NF-κB蛋白水平升高(P<0.05)，與牙髓炎組比較，黃芩苷組牙髓組織中TLR4和NF-κB蛋白水平降低(P<0.05)。見表4、圖2。

3 討論

牙髓炎的主要病因是病原微生物感染，厭氧菌是牙髓炎的優(yōu)勢(shì)菌，以革蘭陰性菌最多；細(xì)菌進(jìn)入牙髓后可產(chǎn)生多種有害物質(zhì)，產(chǎn)生的有害物質(zhì)可直接損傷組織細(xì)胞，或通過免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等間接損傷組織。感染牙髓的厭氧菌的內(nèi)毒素、菌體表面物質(zhì)、各種毒性酶等均為致病物質(zhì)，其中革蘭陰性菌細(xì)胞壁產(chǎn)物-內(nèi)毒素是比較重要的毒性產(chǎn)物，內(nèi)毒素的主要毒性成分為脂多糖中的類脂A，脂多糖是引起細(xì)胞損傷的主要毒力因子[9]。脂多糖對(duì)牙髓的損傷表現(xiàn)在：脂多糖為低分子物質(zhì)，具有比較強(qiáng)的滲透性，因此更容易通過牙本質(zhì)小管、牙根尖孔以及牙側(cè)支根管等，刺激牙髓組織，使牙髓組織處于炎癥狀態(tài)[10]；脂多糖對(duì)牙髓成纖維細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，可引起牙髓的免疫、炎癥反應(yīng)；脂多糖是一種強(qiáng)烈的致炎因子，在炎癥牙髓中聚集了大量樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，上述細(xì)胞作為脂多糖的靶細(xì)胞，將脂多糖的炎癥信號(hào)通過TLR4等傳遞到細(xì)胞內(nèi)[11,12]，刺激NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核中，激活TNF-α、IL-6、IL-8、IL-2等基因表達(dá)，從而啟動(dòng)炎癥反應(yīng)[13-15]。本研究通過對(duì)大鼠磨牙開髓并在開髓孔處放置脂多糖建立牙髓炎模型，發(fā)現(xiàn)牙髓炎模型大鼠牙髓組織出現(xiàn)明顯炎癥反應(yīng)，牙髓組織中TNF-α、IL-6含量升高，TLR4和NF-κB mRNA和蛋白水平也升高，表明脂多糖建立牙髓炎模型成功，脂多糖刺激牙髓中的樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等靶細(xì)胞，將脂多糖的炎癥信號(hào)通過TLR4等傳遞到細(xì)胞內(nèi)，刺激NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核中，從而激活TNF-α、IL-6等下游炎癥細(xì)胞因子，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致牙髓炎的發(fā)生。

黃芩的干燥根是藥用部分，黃酮類化合物為其主要成分，包括黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、黃芩新素等[16,17]，其中黃芩苷是藥理作用最強(qiáng)的有效成分，具有抗菌、消炎、抗氧化、清除自由基、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)效應(yīng)[8-20]。黃芩苷可通過多種信號(hào)通路發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，在抑制炎癥反應(yīng)中，可通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用，如歐陽(yáng)龍強(qiáng)等[21]研究發(fā)現(xiàn)小鼠癲癇發(fā)作后可激活TLR4/NF-κB介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路引起海馬神經(jīng)細(xì)胞的損傷，黃芩苷可通過抑制信號(hào)通路及其下游炎癥細(xì)胞因子水平，發(fā)揮對(duì)癲癇小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用；李敏等[22]研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制CCL4誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而改善肝纖維化。本研究對(duì)牙髓炎大鼠采用黃芩苷糊劑蓋髓，發(fā)現(xiàn)與牙髓炎組比較，黃芩苷組大鼠牙髓組織炎癥反應(yīng)級(jí)別和組織紊亂程度均降低，TNF-α、IL-6含量降低，TLR4和NF-κB mRNA和蛋白水平也降低。表明黃芩苷對(duì)牙髓炎具有抑制作用，其機(jī)制可能為黃芩苷通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制脂多糖炎癥信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)，從而抑制其下游TNF-α、IL-6等炎癥細(xì)胞因子的激活，通過抑制炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)發(fā)揮對(duì)牙髓炎的抑制作用，保護(hù)牙髓細(xì)胞。

綜上所述，黃芩苷具有抑制牙髓炎癥反應(yīng)的作用，其機(jī)制可能為黃芩苷通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路及其下游炎癥細(xì)胞因子的激活從而抑制牙髓炎的炎癥反應(yīng)。