鄭建宇，劉 晶，周桂園，，殷沛沛，董高峰，王保興，吳建霖，李美紅，周 瀟，尚可超

1. 中煙施偉策（云南）再造煙葉有限公司， 云南省玉溪市紅塔區(qū)大營街蔡官屯89 號 653100

2. 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心， 昆明市五華區(qū)龍泉路548 號 650202

煙草提取物通常經(jīng)加熱提取和減壓濃縮制備得到。煙草提取物中對抽吸品質(zhì)有負(fù)面影響的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖等分子量較大的成分未被除去，而對感官特征有重要作用的小分子和易揮發(fā)成分未經(jīng)過富集，其質(zhì)量和功能特征的穩(wěn)定性主要取決于煙草原料［1-6］，由于煙草原料的波動對料液特征的影響較大，因此有必要采用適當(dāng)?shù)姆蛛x純化技術(shù)對煙草提取物進(jìn)行處理。膜分離技術(shù)具有分離和濃縮同步進(jìn)行的特點(diǎn)［7］，采用該技術(shù)在室溫下處理煙草提取物時(shí)，可最大限度地富集熱敏性的致香物質(zhì)和易揮發(fā)成分［8-10］，減少這些成分的加工損失。通過超濾膜組合分離技術(shù)，可對提取物中各類組分定向分離與截流，富集對感官特征有功能性作用的有效部分，去除對口感有負(fù)面影響以及煙氣中焦油和CO 前體物的成分［11］，從而實(shí)現(xiàn)各類組分的重組和相關(guān)產(chǎn)品香韻的調(diào)節(jié)，提高其各類化學(xué)成分的可調(diào)控性和在卷煙配方中的適用性。近年來，多級膜組合技術(shù)應(yīng)用廣泛，比如天然產(chǎn)物的分離純化及富集［12-16］，飲用水和工業(yè)用水的凈化與循環(huán)利用［17-19］，飲料及酒制品的濃縮和凈化［10，20］，制藥工業(yè)中活性成分的制備及細(xì)菌和熱原的去除［21-24］。目前，多級膜組合技術(shù)在煙草提取物的分離、除雜、濃縮及感官評價(jià)方面的應(yīng)用研究較少［4-5］。因此，設(shè)計(jì)5 級超濾膜組合，將煙草提取物按分子量大小進(jìn)行分組，考察各級膜截留液的主要化學(xué)成分及含量的變化，旨在篩選煙葉提取物中的有效部分，提高煙草提取物在再造煙葉上的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

2016 年昆明石林生產(chǎn)的K326 品種C3F 等級的煙葉，由云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供。

二氯甲烷、無水硫酸鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙酸苯乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%，美國Sigma 公司）。

R-220SE 旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā) 儀（瑞 士Büchi 公 司）；Milli-Q Element 型超純水儀（美國Millipore 公司）；GCM-S-02 卷式膜過濾系統(tǒng)（國初科技廈門有限公司）；10 kDa、2 kDa、1 kDa、700 Da、300 Da 的聚醚砜 膜 元 件（ 德 國 Microdyn-Nadir 公 司）；BSA224S-CW 電子天平（感量0.000 1 g）、G-26C 高速離心機(jī)（德國Sartorius 公司）；7890B/5977A 氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國Agilent 公司）；FUTURA-II Alliance 連續(xù)流動分析儀（法國Alliance 公司）。

1.2 方法

1.2.1 超濾樣品的制備

準(zhǔn)確稱取1 000 g 煙葉，加入7 L 水加熱提取，60 ℃下提取2 次；合并煙草提取液，用濾紙減壓過濾，取200 mL 濾液留樣，供檢測和評價(jià)使用。將其余提取物加入過濾系統(tǒng)的進(jìn)樣端，依次經(jīng)過10 kDa、2 kDa、1 kDa、700 Da 和300 Da 五級膜分離。根據(jù)膜材的耐壓性和通量上限及樣品的實(shí)際通量，適當(dāng)調(diào)控進(jìn)出口壓力差（≤0.6 MPa），五級膜實(shí)際通量分別為86.5、22.0、19.0、10.0、3.0 L/h·m2，工作溫度低于30 ℃。當(dāng)截留液體積明顯減少，濾液流速明顯降低時(shí)，加入適量純化水繼續(xù)過濾，重復(fù)3 次后更換膜件進(jìn)行下一級過濾。分別收集截留液和濾液待用。

1.2.2 常規(guī)化學(xué)成分的檢測

使用連續(xù)流動分析儀，分別按照YC/T 159—2002、YC/T 160—2002 和YC/T 161—2002 對各級膜截留液的總糖、還原糖、總植物堿和總氮進(jìn)行含量測定［25-27］，檢測結(jié)果通過各級膜截留液的得率換算為100 g 煙葉中4 類化學(xué)成分的質(zhì)量，評價(jià)各級膜對總糖、還原糖、總植物堿和總氮的富集效果。

1.2.3 揮發(fā)性香味成分的檢測

前處理：分別稱取1.2.1 節(jié)中制備的相當(dāng)于1 g固含物的截留液，濃度較高時(shí)加水稀釋至相近體積，再加入等體積的二氯甲烷分別萃取3 次；合并萃取液，加入無水硫酸鈉干燥過夜；轉(zhuǎn)入燒瓶中，并加入內(nèi)標(biāo)物（乙酸苯乙酯）50 μg，于40 ℃下常壓濃縮至1 mL，待測。GC-MS 分析條件為：

色譜柱：HP-5MS 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；程序升溫：初始溫度50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升至260 ℃，保持1 min，再以16 ℃/min升至300 ℃，保持4 min；載氣：高純氦氣，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比10∶1；進(jìn)樣體積：1 μL。離子源：EI；電離能：70 eV；離子源溫度：180 ℃；傳輸線溫度：260 ℃；檢測模式：全離子掃描監(jiān)測；質(zhì)量掃描范圍：30～750 amu；溶劑延遲：2 min；根據(jù)NIST11 譜庫檢索，以匹配度≥80%進(jìn)行定性。

GC-MS 半定量方法：根據(jù)某化合物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比與濃度比成正比，計(jì)算該化合物的含量。假設(shè)內(nèi)標(biāo)物的相對校正因子為1，按公式Wi=Ai/As·Ws計(jì)算。其中，Wi為組分i 的質(zhì)量，Ai為組分i峰面積，As為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Ws為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量。最終組分含量單位換算為μg/g，各化合物含量再對應(yīng)到各級膜截留液的總量和得率，換算為100 g 煙葉中各化合物的質(zhì)量。

1.2.4 再造煙葉樣品的制備和感官評價(jià)

根據(jù)各級膜截留液和原提取物的固含量，以等量方式加入涂布配方中制樣，在恒溫恒濕條件下平衡24 h，切絲卷制后進(jìn)行感官評吸。

2 結(jié)果與討論

2.1 各級膜截留液的固含量和得率

將1.2.1 節(jié)中制備的樣品準(zhǔn)確稱量，得到各級膜截留液總量，采用烘箱法［28］測試固含量，計(jì)算公式：得率=樣品總量×固含量/原煙葉質(zhì)量，結(jié)果見表1。可以看出，將原提取物進(jìn)行超濾膜組合分級過濾后，10 kDa、300 Da 膜截留液和300 Da 膜濾液的得率較高，2 和1 kDa 膜截留液的得率偏低。截留液和濾液的固含物累加值僅為原液固含物質(zhì)量的86%，可能是由于在各級膜分離過程中，特別是更換下一級膜時(shí)有一定量的物質(zhì)損失，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將2 和1 kDa 膜截留液合并，即樣品經(jīng)過10 kDa 過濾后，不再進(jìn)行2 kDa 過濾，依次通過1 kDa、700 Da 和300 Da 膜 繼 續(xù) 過 濾，從 而 提 高得率。

表1 各級膜截留液的固含量和得率Tab.1 Solid content and yield of retentate of each membrane

2.2 常規(guī)化學(xué)成分的變化

采用連續(xù)流動分析法對1.2.1 節(jié)中制備的樣品進(jìn)行測試，根據(jù)各級膜截留液的總量和固含量，以100 g 原煙葉計(jì)，換算得到總糖、還原糖、總氮和總植物堿隨著超濾膜孔徑變化的富集量，結(jié)果見表2和圖1。

由表2 和圖1 可以看出，各級膜截留液和濾液的糖含量累加值僅為原液中糖含量的50%左右，若按2.1 節(jié)的得率計(jì)，應(yīng)該為80%左右。煙草提取物原液是固含量為2.73%的低濃度樣品，而各級膜截留液的測試樣品是濃縮后固含量較高的樣品，部分分子量較大的糖類物質(zhì)溶解性降低，在進(jìn)行樣品前處理時(shí)形成部分沉淀，例如，10 kDa 膜截留液的沉淀就比較多，這些沉淀可能包含部分糖類物質(zhì)。為了符合儀器測試需求，需將這些沉淀濾去，從而導(dǎo)致各級膜截留液的糖類物質(zhì)實(shí)測值累加后低于原液中的糖含量。

10 kDa 膜截留液的總糖含量最高，還原糖含量較低，10 kDa 膜截留液中非還原糖含量為2.88 g/100 g，而其他各級膜截留液和濾液中的非還原糖總量為0.85 g/100 g。由于大部分多糖無還原性，因此認(rèn)為10 kDa 膜截留了煙葉提取物中的大部分多糖，截留總量約為4.03 g/100 g 煙葉。

從2 kDa～300 Da，隨著超濾膜孔徑的降低，還原糖含量呈逐漸上升趨勢。還原糖在300 Da 膜的截留液和濾液中含量較高，分別為2.32 和3.31 g/100 g 煙葉。

總植物堿主要富集在300 Da 膜截留液中，其含量超過了其他各級膜截留液的總和。300 Da 膜濾液中的總植物堿富集量約為其他各級膜截留液煙堿量的55%。兩部分的煙堿量之和占原煙葉總植物堿含量的70%以上。

表2 各級膜截留液的化學(xué)成分①Tab.2 Chemical components in retentate of each membrane （g）

對比總氮和總植物堿可知，10 kDa 膜截留液的總氮遠(yuǎn)高于總植物堿，因此認(rèn)為10 kDa 膜截留液的總氮主要為除生物堿之外的以蛋白質(zhì)為主的有機(jī)氮成分，這也說明10 kDa 膜具有截留煙葉提取物中蛋白質(zhì)類成分的重要作用。

圖1 各級膜截留液的化學(xué)成分比較Fig.1 Comparison of chemical components in retentate of each membrane

2.3 揮發(fā)性成分的變化

按1.2.3 節(jié)的前處理和檢測方法對1.2.1 節(jié)中制備的樣品進(jìn)行分析測試，共鑒定出71 個(gè)成分，其中醇類11 個(gè)，酮類19 個(gè)，醛類1 個(gè)，酯類10 個(gè)，酚類3 個(gè)，酸類4 個(gè)，雜環(huán)類17 個(gè)，烴類6 個(gè)；采用AMDIS 方式進(jìn)行積分，通過半定量法計(jì)算后結(jié)合各級膜截留液的固含量和得率，將各成分換算為100 g 煙葉中的質(zhì)量，結(jié)果見表3。

由表3 可以看出，與其他截留液相比，300 Da膜濾液中的特有成分較多，包括：乙酸-1-羥基-2-丙酯、泛酰內(nèi)酯、N-甲基吡咯烷酮、甲基吡咯烷酮、N-甲基丁二酰胺、麥芽酚、琥珀酰亞胺、2-己烯-4-醇、戊二酰亞胺、2-氮己環(huán)酮、γ-羥甲基-γ-丁內(nèi)酯、苯甲酸、乙琥胺、苯乙酸、吲哚、2,6-二甲基-2,7-辛二烯-1,6-二醇、對羥基苯乙醇、N-甲基煙酰胺、香草乙酮、2,3'-聯(lián)吡啶、高香草醇、2,4-二羥基苯甲醛、乙酰丁香酮、3-吲哚乙醇、6,7-二甲氧基香豆素、新植二烯和正二十六烷。

300 Da 膜截留液的特有成分包括：乙酸丁酯、1-辛烯-3-酮、苯甲醇、1,3,7,7-四甲基-2-氧雜雙環(huán)［4.4.0］-5-葵烯-9-酮、八氫-2,5,5,8a-四甲基-7H-1-苯并吡喃-7-酮、4-羥基-β-二氫大馬酮、6-甲基煙酸。

700 Da 膜截留液的特有成分包括：甲酸異丁酯、苯乙醇、α-亞甲基-γ-戊內(nèi)酯、茄酮、二烯煙堿、巨豆三烯酮、松柏醇。

1 kDa 膜截留液的特有成分包括：丙酸、乙酸丙酯、吡啶、丙酸丙酯和乙酸正十七烷基酯。

2 kDa 膜截留液的特有成分為乙酸仲丁酯。

10 kDa 膜截留液的特有成分為N,N-二甲基乙酰胺。

表3 各級膜截留液的揮發(fā)性成分及含量Tab.3 Volatile components and their contents in retentate of each membrane （μg·100 g-1）

表3 （續(xù)）

表3 （續(xù)）

部分組分存在于各級膜截留液中，如保留時(shí)間在2～6 min 的小分子化合物，原液中沒有檢出。原因是不同孔徑的超濾膜對各類成分有富集作用，即使原液中上述成分的含量低于檢出限，而富集后可被檢出。

有些組分在原液中含量較高、但截留液和濾液中檢出值較低。這是由于這些組分的水溶性稍差，分離過程中在膜件上形成了死吸附［29-32］，因此原液中這些組分的含量遠(yuǎn)高于各級膜截留液中的含量。

10、2 和1 kDa 膜截留液的揮發(fā)性香味成分的種類和含量均較低，對產(chǎn)品香氣特征的貢獻(xiàn)較?。粺熑~中的特征性成分茄酮、巨豆三烯酮和二烯煙堿主要富集在700 Da 膜截留液中；煙堿及其衍生物去氫新煙堿、可替寧和6-甲基煙酸主要富集在300 Da 膜截留液中；300 Da 膜濾液富集的小分子化合物最多，若不計(jì)煙堿，以原煙葉提取物計(jì)，該部分的揮發(fā)性成分總量最高，達(dá)到207.81 μg/g。

2.4 各級膜截留液對再造煙葉感官質(zhì)量的影響

參考杜銳等［4］的評價(jià)方法，由5 名具有專業(yè)資質(zhì)的感官評吸人員對1.2.4 節(jié)中制備的樣品進(jìn)行對比評吸，結(jié)果見表4?？梢钥闯觯?0、2 和1 kDa 膜截留液加入配方后，香氣質(zhì)和香氣量等指標(biāo)均較對照（原提取液）差，具體表現(xiàn)為焦煳味重，刺激性大，香氣不清晰；而700 Da、300 Da 膜截留液和300 Da 膜濾液對上述感官指標(biāo)有明顯的改善作用，具體表現(xiàn)為煙氣的清甜感和綿柔感增加，香氣更豐富，雜氣和刺激性明顯降低。原煙葉（K326）的頭香和體香特征較明顯。

表4 各級膜截留液的感官評價(jià)結(jié)果①Tab.4 Sensory evaluation result of retentate of each membrane

3 結(jié)論

采用超濾膜組合工藝進(jìn)行煙葉提取物處理時(shí)，10 kDa、300 Da 膜截留液和300 Da 膜濾液的得率較高，2 和1 kDa 膜截留液的得率較低，300 Da超濾膜有利于還原糖和總植物堿的富集，10 kDa超濾膜有利于多糖和蛋白質(zhì)類成分的富集。通過10 kDa 和300 Da 兩級膜組合可以實(shí)現(xiàn)煙葉提取物中多糖、蛋白質(zhì)和還原糖及總植物堿的調(diào)控。

10、2 和1 kDa 膜截留液的揮發(fā)性香味成分的種類和含量都較低，對產(chǎn)品香氣特征的貢獻(xiàn)較小。煙葉的特征性成分在700 和300 Da 兩級膜上的富集各有特色，多數(shù)煙葉中常見的小分子醇、酮、酯和雜環(huán)類成分都富集在300 Da 膜的濾液中，其對產(chǎn)品的香氣特征有重要作用。通過適當(dāng)?shù)某瑸V膜組合可以富集和制備目標(biāo)組分，從而可實(shí)現(xiàn)各類成分的調(diào)控。

10、2 和1 kDa 膜截留液對再造煙葉感官品質(zhì)有明顯的負(fù)面影響，而700 Da、300 Da 膜截留液和300 Da 膜濾液對感官特征有明顯的改善作用，具體表現(xiàn)為香氣較豐富，原煙葉的頭香和體香特點(diǎn)突出。本研究結(jié)果可為應(yīng)用膜分離技術(shù)開發(fā)各種煙用香料和對其各類化學(xué)成分進(jìn)行調(diào)控提供參考。