王美垚 李全杰

摘要?采用同源克隆法獲得了刀鱭PEPCK基因全長(zhǎng)cDNA序列，其具有高度保守的結(jié)構(gòu)序列及功能位點(diǎn)，進(jìn)化分析表明其與同屬鯡形目的大西洋鯡具有最近的進(jìn)化距離。在饑餓作用下刀鱭肝組織表達(dá)研究表明，PEPCK在糖異生調(diào)節(jié)方面，在對(duì)于饑餓作用下協(xié)調(diào)糖類代謝平衡，進(jìn)而維持能量代謝供給上發(fā)揮了積極作用。該研究為今后進(jìn)一步開展刀鱭抗環(huán)境因子變化調(diào)控機(jī)制提供了理論參考。

關(guān)鍵詞?刀鱭;磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶;克隆;饑餓;表達(dá)

中圖分類號(hào)?S?917.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2019）23-0107-08

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.031

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Molecular Cloning of PEPCK Gene in Coilia nasusand Its Expression Analysis under Starvation

WANG Mei?yao1，2，3， LI Quan?jie2

（1.Wuxi Fisheries College， Nanjing Agricultural University， Wuxi， Jiangsu 214081;

2.Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Freshwater Fisheries Research Center， Chinese Academy of Fishery Sciences， Wuxi， Jiangsu 214081;3.Aquatic Animals Genome Center， Freshwater Fisheries Research Center， Chinese Academy of Fishery Sciences， Wuxi， Jiangsu 214081）

Abstract?cDNA sequence of PEPCK gene in C. nasus was cloned by using homologous cloning method， which had highly?conserved sequence and functional sites. Phylogenetic analysis showed that C. nasus had the closest phylogenetic relationship with Clupea harengus in the same family with it. The expression study of liver tissue in C. nasus under starvation showed that PEPCK performed key regulatory function in gluconeogenesis， maintaining energy homeostasis under starvation stress. This research would provide theoretical references for further research on anti?stress regulation mechanism in future.

Key words?Coilia nasus;PEPCK;Cloning;Starvation;Expression

磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶（PEPCK）是糖異生作用中的關(guān)鍵酶，可催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸，進(jìn)而最終形成葡萄糖，以供機(jī)體能量代謝所需[1]。根據(jù)PEPCK在細(xì)胞內(nèi)的分布可分為細(xì)胞質(zhì)型和線粒體型2種亞型，二者分別由核基因Pck1和Pck2編碼而成[1-2]。2種亞型PEPCK在生物體內(nèi)的比例在不同物種間具有較明顯的差異性。在水產(chǎn)動(dòng)物、哺乳動(dòng)物上具有細(xì)胞質(zhì)型和線粒體型PEPCK，而在植物中只存在細(xì)胞質(zhì)型PEPCK[3]?，F(xiàn)已在高等動(dòng)物及水生動(dòng)物[包括人類（Homo sapiens）、小鼠（Mus musculus）、翹嘴紅鲌（Culter alburnus）、金頭鯛（Sparus aurata）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、大西洋鮭（Salmo salar）等]中克隆獲得了PEPCK的 cDNA序列[4-7]。研究表明，PEPCK廣泛存在于不同種生物（包括人類、微生物、水產(chǎn)動(dòng)物等）的各個(gè)組織中，包括腦、鰓、心、脾、種子、果實(shí)等[8-10]。在水產(chǎn)動(dòng)物上開展的相關(guān)研究表明，外界環(huán)境因子（如鹽度等）以及飼料組成的變化會(huì)對(duì)其表達(dá)水平產(chǎn)生影響[4，11-14]。

刀鱭為溯河洄游性魚類，其在洄游期間餌料的可獲得性將會(huì)受到影響，因而探討?zhàn)囸I對(duì)洄游性魚類的影響研究具有重要意義。迄今為止，在刀鱭上未見到相關(guān)報(bào)道。筆者開展了刀鱭PEPCK序列克隆及饑餓作用下的表達(dá)分析，旨在為今后進(jìn)一步開展刀鱭在洄游中抗饑餓作用的機(jī)體代謝調(diào)控研究提供一定的理論參考。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)魚飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)魚為平均體重（8.6±0.5）g，體長(zhǎng)（14.36±0.80）cm的5月齡刀鱭幼魚，采自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興屺亭養(yǎng)殖基地。試驗(yàn)前14 d，將魚拉網(wǎng)分別暫養(yǎng)于室內(nèi) 5個(gè)規(guī)格為5 m×3 m×1 m的循環(huán)水水泥池中，其中一個(gè)養(yǎng)殖池用于向其余4個(gè)用于試驗(yàn)的養(yǎng)殖池補(bǔ)充刀魚。試驗(yàn)期間連續(xù)增氧，進(jìn)行水質(zhì)監(jiān)測(cè)，水溫為（18.0±0.6）℃，pH為7.2，溶解氧濃度為（8.5±0.6）mg/L，氨態(tài)氮濃度≤0.01 mg/L，亞硝酸鹽濃度≤001 mg/L。每天07：00和17：00投喂2次，以飽食為宜。

1.2?試驗(yàn)設(shè)計(jì)與組織采集

試驗(yàn)設(shè)定對(duì)照組和試驗(yàn)組各3個(gè)平行，每組試驗(yàn)魚15尾。對(duì)照組正常投喂，試驗(yàn)組在試驗(yàn)期間不投喂。于饑餓試驗(yàn)開始后的0、2、8、14、20、26、32 d采樣。分別從對(duì)照組與試驗(yàn)組各采集2尾魚，將魚置于濃度為40 mg/L的MS-222麻醉劑中麻醉10 s，采集血液，制備血清。于饑餓0 d采樣時(shí)，從對(duì)照組魚中取100 mg的鰓、腦、肝、脾、心、腎、脂肪組織、胃、肌肉，迅速凍于液氮中，以備后續(xù)試驗(yàn)。于后續(xù)試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)采樣時(shí)，只采集肝組織，存于液氮中并采集血液，制備血清。對(duì)于采集的魚體均要進(jìn)行形態(tài)參數(shù)測(cè)量，包括體長(zhǎng)、體重、內(nèi)臟重和肝重。

1.3?總RNA 的提取和PEPCK基因中間序列的獲得

取提取的總RNA，根據(jù)NCBI網(wǎng)站上大西洋鯡（Clupea harengus，XM_012837427.1）、斑馬魚（Ddanio rerio，NM_214751.1）、大菱鲆（Scophthalmus maximus，KC149517.1）、大西洋鮭（Salmo salar，NM_001140449.1）、大黃魚（Larimichthys crocea，XM_019275494.1）、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus，XM_003448375.3）、人類（H.sapiens，NM_002591.3）、小鼠（M.musculus，AF009605.1）等基因的cDNA的保守區(qū)序列使用Prime Premier 5軟件設(shè)計(jì)正反引物P1和P2（表1）。使用PrimeScript One Step Enzyme Mix（TaKaRa，日本）進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：50 ℃ 30 s;94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃反應(yīng)30 s，57 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸1 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit（TaKaRa，日本）回收長(zhǎng)度700 bp的目的片段，將其連接至pMD18-T載體（TaKaRa，日本）并轉(zhuǎn)入E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)（TaKaRa，日本），送至上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序，獲得850 bp片段，經(jīng)NCBI網(wǎng)站Blastx比對(duì)證實(shí)它是PEPCK同源序列。

1.4?刀鱭PEPCK基因5′、3′ RACE擴(kuò)增試驗(yàn)

根據(jù)測(cè)得的刀鱭PEPCK中間段序列，設(shè)計(jì)5′-RACE與3′-RACE特異性引物P3～P6（表1）。使用RACE方法擴(kuò)增刀鱭PEPCK基因的5′端與3′端序列?；厥漳康钠危瑢⑵溥B接至pMD18-T 載體（TaKaRa，日本）并轉(zhuǎn)入E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞（TaKaRa，日本）內(nèi)測(cè)序。然后，使用ContigExpress軟件將保守區(qū)序列、5′端序列以及3′端序列進(jìn)行拼接，得到刀鱭PEPCK全長(zhǎng)cDNA序列。

1.5?PEPCK核酸及推導(dǎo)的氨基酸序列分析

使用SMS序列在線處理工具包（http：//www.bio-soft.net/sms/index.html）將LPL與PEPCK的cDNA序列分別翻譯為氨基酸序列，使用等電點(diǎn)與分子量在線預(yù)測(cè)軟件（http：//isoelectric.ovh.org/）進(jìn)行分析，用SOPMA在線工具（http：//nhjy.hzau.edu.cn/kech/swxxx/jakj/dianzi/Bioinf7/Expasy/Expasy8.html）分析推導(dǎo)的氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)，使用TMPRED在線軟件（http：//www.expasy.org/tools/protscale.html）分析跨膜結(jié)構(gòu)，使用PROSITE在線工具（http：//au.expasy.org/prosite/）分析功能域，使用DNAstar軟件中的MegAlign比對(duì)氨基酸序列同源性，使用Mega 5.0軟件采用鄰接法（neighbour?joining）構(gòu)建相關(guān)物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹，相關(guān)物種及其PEPCK登錄號(hào)如下：大西洋鯡（C.haregus，XP_012692881.1）、花鱸（lateolabrax japonicus，ACN93989.1）、大黃魚（L.crocea，XP_019131039.1）、羅非魚（O.niloticus，XP_003448423.1）、大西洋鮭（S.salar，NP_001133921.1）、斑馬魚（D.rerio，NP_999916.1）、暗紋東方鲀（Takifugu fasciatus，XP_003973103.1）、大菱鲆（S.maximus，AGJ83085.1）、人類（H.sapiens，NP_002582.3）、小鼠（M.musculus，NP_035174.1）。

1.6?刀鱭PEPCK基因的組織表達(dá)分析

1.6.1?刀鱭PEPCK基因在各組織中的表達(dá)分析。

取對(duì)照組0 h時(shí)間點(diǎn)的刀鱭留存的各組織（包括鰓、腦、肝、脾、心、腎、肌肉等）開展實(shí)時(shí)熒光定量分析。根據(jù)已報(bào)道的β-actin序列，比對(duì)分析，設(shè)計(jì)刀鱭內(nèi)參基因β-actin的特異引物P7和P8，根據(jù)獲得的刀鱭PEPCK全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異引物P9、P10，用于擴(kuò)增185 bp片段。引物序列見表1。在ABI7500（ABI，美國(guó)）上開展實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 50 s，40個(gè)循環(huán)。各平行組各取2尾刀鱭，每個(gè)樣品做3次重復(fù)，采用2-ΔΔCt 法計(jì)算PEPCK的mRNA相對(duì)表達(dá)量。使用SPSS 21.1統(tǒng)計(jì)軟件采用單因素分析法中的Ducans多重比較法進(jìn)行分析，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

1.6.2?刀鱭PEPCK基因在饑餓作用下肝組織中的表達(dá)分析。

取對(duì)照組和試驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)（包括0、2、8、14、20、26、32 d）的刀鱭肝組織，各平行組各取2尾刀鱭，每個(gè)樣品做3次重復(fù)，試驗(yàn)方法及數(shù)據(jù)分析方法同“1.6.1”。

1.7?刀鱭形態(tài)參數(shù)及血清指標(biāo)的測(cè)定

對(duì)對(duì)照組和試驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)（包括0、2、8、14、20、26、32 d）采集的刀鱭，測(cè)量其體重、肝重和內(nèi)臟重，對(duì)制備的血清測(cè)定皮質(zhì)醇、血糖和溶菌酶含量。皮質(zhì)醇（COR）采用放免法（RIA）進(jìn)行測(cè)定，試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所。血糖（GLU）用葡萄糖氧化酶一過(guò)氧化物酶終點(diǎn)比色法，試劑盒購(gòu)自衛(wèi)生部上海生物制品研究所，使用美國(guó)貝克曼Cx-4型自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。溶菌酶含量測(cè)定所用試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。數(shù)據(jù)分析方法同“1.6.1”。

2?結(jié)果與分析

2.1?刀鱭PEPCK的序列及結(jié)構(gòu)分析

如圖1所示，通過(guò)RACE方法克隆獲得的刀鱭PEPCK全長(zhǎng)cDNA序列（GenBank登錄號(hào)為KX345852）共2 394 bp，其中5′端UTR為201 bp，開放閱讀框?yàn)? 872 bp，3′端UTR長(zhǎng)度為321 bp，編碼623個(gè)氨基酸（圖1）。理論等電點(diǎn)為5.46，蛋白分子量為68.6 ku。其中包含73個(gè)堿性氨基酸（精氨酸+賴氨酸+組氨酸）和72個(gè)酸性氨基酸（天冬氨酸+谷氨酸）。刀鱭PEPCK蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋（30.98%）、延伸鏈（21.19%）、β-轉(zhuǎn)角（10.91%）以及隨機(jī)卷曲（36.92%）。如圖2所示，刀鱭PEPCK具有其特有的高度保守的與草酰乙酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，還具有與三磷酸鳥苷及Mg2+結(jié)合的2個(gè)激酶基序結(jié)構(gòu)。

2.2?刀鱭PEPCK的系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用Mega5.0軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）分析結(jié)果表明，水產(chǎn)動(dòng)物與哺乳動(dòng)物PEPCK各自聚為一類。其中，刀鱭與大西洋鯡同屬鯡形目，二者聚為一分支;花鱸與大黃魚的PEPCK序列具有較近的遺傳距離，二者聚為同一分支，而后依次與大菱鲆、羅非魚、暗紋東方鲀、大西洋鮭、刀鱭與大西洋鯡、斑馬魚聚類。

2.3?刀鱭PEPCK基因的組織表達(dá)分析

2.3.1?刀鱭PEPCK基因在各組織中的差異表達(dá)分析。

在對(duì)刀鱭8個(gè)組織中開展的PEPCK實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果表明，PEPCK在肝、腸、腦、心、腎組織中均有表達(dá)。其中，在肝組織中的表達(dá)量最高，其次為腎和腸組織，且三者顯著高于

其他組織，而其在腦中的表達(dá)量最低。PEPCK在各組織中的表達(dá)量從高到低依次為肝、腎、腸、心、腦（圖4）。

2.3.2?饑餓作用下刀鱭肝組織中PEPCK基因的表達(dá)分析。

從圖5可以看出，刀鱭肝組織中PEPCK表達(dá)水平在饑餓2 d后出現(xiàn)顯著上升（P>0.05），而在饑餓8 d后略有下降，但仍顯著高于饑餓前水平（P<0.05），至饑餓14 d后肝組織中PEPCK表達(dá)水平仍高于饑餓前水平（P>0.05），而在饑餓26～32 d肝中PEPCK表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)（P<005）。

2.4?饑餓對(duì)刀鱭形態(tài)指標(biāo)及血清激素、免疫指標(biāo)的影響

由表2可知，在饑餓期，刀鱭體重逐漸下降，但差異不顯著（P>0.05）。肝體比在饑餓26 d內(nèi)有所下降，但差異不顯著（P>0.05），直至饑餓32 d后出現(xiàn)顯著下降（P<0.05）。血糖含量總體上也呈下降趨勢(shì)，在饑餓8 d血糖含量出現(xiàn)大幅度下降，但差異不顯著（P>0.05），此后有所回升，但在整個(gè)饑餓期間呈下降趨勢(shì)。血清皮質(zhì)醇含量在饑餓8 d出現(xiàn)顯著升高（P<0.05），此后有所回落，至饑餓32 d仍高于對(duì)照組水平。血清溶菌酶含量直至饑餓應(yīng)激持續(xù)26 d均無(wú)顯著變化（P>0.05），但應(yīng)激32 d出現(xiàn)顯著降低。

3?討論

3.1?刀鱭PEPCK的序列、結(jié)構(gòu)及進(jìn)化分析

磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶是糖異生過(guò)程中重要的限速酶，可催化草酰乙酸生成磷酸式丙酮酸。其具有保守的結(jié)構(gòu)域，包括與草酰乙酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及與GTP結(jié)合的2個(gè)激酶基序[4，11-12]。該研究克隆所得刀鱭PEPCK序列具有上述保守結(jié)構(gòu)，這也體現(xiàn)了PEPCK的結(jié)構(gòu)保守性。通過(guò)與已報(bào)道的其他物種PEPCK序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果表明魚類與哺乳類分別聚為兩大分支。刀鱭PEPCK序列與同屬鯡形目的大西洋鯡具有最近的遺傳距離。PEPCK的聚類結(jié)果并不似LPL結(jié)果，由淡水魚和海水魚分別聚類，而是淡水魚與海水魚的PEPCK序列交錯(cuò)聚類。但哺乳動(dòng)物與水產(chǎn)動(dòng)物的PEPCK最終分別聚群。總體來(lái)看，PEPCK的進(jìn)化關(guān)系符合物種間的遺傳關(guān)系，在水產(chǎn)動(dòng)物與哺乳動(dòng)物間具有一定差異，但在淡水魚與海水魚間PEPCK序列進(jìn)化關(guān)系并非似物種間進(jìn)化差異那樣明顯。

3.2?饑餓作用下刀鱭PEPCK對(duì)魚體的調(diào)控作用

糖異生是指將一些非糖前體，包括乳酸、生糖氨基酸（如丙氨酸等）轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?，以維持機(jī)體血糖恒定同時(shí)為機(jī)體提供能量所需。糖異生作用也是生物體在饑餓期間的關(guān)鍵供能方式，同時(shí)肝組織也是重要的糖異生場(chǎng)所，對(duì)于調(diào)節(jié)糖類代謝平衡發(fā)揮重要作用[15-17]。PEPCK可催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸，而最終形成葡萄糖，是糖異生作用的關(guān)鍵限速酶，在調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝上發(fā)揮重要作用[1-2]。該研究中刀鱭肝組織中PEPCK表達(dá)水平在饑餓2～14 d均出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，饑餓20～32 d出現(xiàn)下降，即在饑餓期間PEPCK表達(dá)水平有升降變化，但這仍體現(xiàn)了肝中PEPCK在促進(jìn)糖異生作用、增強(qiáng)機(jī)體供能上所發(fā)揮的積極調(diào)節(jié)作用。

3.3?饑餓作用對(duì)刀鱭形態(tài)、血清生化指標(biāo)的影響

饑餓作用下，魚體通常首先動(dòng)用糖類及脂類兩類機(jī)體主要能源物質(zhì)，加速其分解代謝，為機(jī)體提供能量，抵消由饑餓對(duì)機(jī)體造成的能量不足，以維持機(jī)體各項(xiàng)生命活動(dòng)順利進(jìn)行[18]。肝臟是魚體代謝的主要器官，也是諸多能源物質(zhì)貯存及轉(zhuǎn)化場(chǎng)所，對(duì)機(jī)體代謝調(diào)控發(fā)揮重要作用[19]。該研究中饑餓作用下刀鱭在饑餓26 d內(nèi)均無(wú)顯著變化，直至32 d后才出現(xiàn)顯著下降，體現(xiàn)了饑餓期間在糖脂等能源物質(zhì)代謝如此旺盛的情況下，仍努力維護(hù)這一組織的重要功能。血糖是重要能量供應(yīng)者，因而恒定的血糖濃度對(duì)于維持魚體各組織各項(xiàng)生理活動(dòng)的正常進(jìn)行發(fā)揮著重要作用。該研究中血糖濃度在饑餓32 d內(nèi)總體呈平穩(wěn)狀態(tài)，僅在饑餓8 d時(shí)出現(xiàn)短暫顯著下降后，此后又出現(xiàn)回升，這也是在饑餓作用下魚體所采用的適應(yīng)性調(diào)節(jié)方式。皮質(zhì)醇是一種腎上腺皮質(zhì)激素，對(duì)于生物體抵抗應(yīng)激因子對(duì)機(jī)體的不利作用發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)也是應(yīng)激期的重要指示因子[20]。該研究中在整個(gè)饑餓期間刀鱭血清皮質(zhì)醇水平出現(xiàn)了顯著升高，這與錢云霞等[18]對(duì)鱸魚開展的饑餓研究結(jié)果相一致，體現(xiàn)了皮質(zhì)醇在抗饑餓脅迫中所發(fā)揮的積極調(diào)節(jié)作用。溶菌酶是一種重要的非特異性防御因子，也是魚體生理防御水平的一個(gè)重要指示物[21]。該研究中溶菌酶水平在饑餓期間總體保持穩(wěn)定水平，直至饑餓32 d才出現(xiàn)顯著下降，體現(xiàn)了饑餓期間刀鱭魚體免疫能力總體上保持穩(wěn)定水平。

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