李鳳巖， 陳亞光， 林大勇， 白 劍

(1. 朝陽市第二醫(yī)院， 遼寧 朝陽， 122000； 2. 遼寧中醫(yī)藥大學， 沈陽 110847)

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)中發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤，在臨床的B超檢測過程中，約有5%左右的甲狀腺結(jié)節(jié)患者最終確診為甲狀腺癌[1]。據(jù)上海市的一項甲狀腺癌的發(fā)病率調(diào)查過程中顯示，甲狀腺癌粗發(fā)病率區(qū)間約為 7.49/10～34.86/10萬，以女性居多，是增長最快的惡性腫瘤之一[2]。在甲狀腺癌的發(fā)病過程中，由于某些基因發(fā)生突變、移位或甲基化等異常變化，引發(fā)相關(guān)信號通路激活，進而導致細胞凋亡或增殖的異常，最終導致癌變的發(fā)生[3]，磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-hydroxykinase-serine/threo-ninekinase， PI3K-AKT) 信號通路是甲狀腺癌發(fā)生過程中的重要信號通路之一，其主要通過調(diào)節(jié)細胞生長及制細胞凋亡，從而誘導甲狀腺細胞發(fā)生癌變[4]，而且AKT的高表達可以增加腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性，降低術(shù)后生存率[5]。

由于晚期或復發(fā)的甲狀腺癌多數(shù)不能夠再次進行手術(shù)治療，而且對放療化療的敏感性下降，因此，尋找安全有效的抗甲狀腺癌藥物是治療的關(guān)鍵。近年來的研究表明，中藥無論是在腫瘤的早期還是不適用手術(shù)治療的腫瘤晚期或?qū)煹哪褪芰ο陆禃r，作為一種必要的治療手段在臨床上均取得了滿意的效果[6]，因此，從中藥中尋找高效低毒的抗腫瘤活性成分已成為腫瘤藥物研究與開發(fā)的熱點之一。中藥甘草具有補脾益氣、祛痰止咳、緩急止痛、清熱解毒、調(diào)和諸藥等功效。甘草酸是發(fā)揮其藥理活性的重要有效成分之一，甘草酸進入體內(nèi)后可以水解為甘草次酸和甘草黃酮等活性成分，其中甘草次酸具有的抑制腫瘤細胞生長的藥理學作用[7]。本研究在此基礎上，在體外通過觀察甘草次酸對甲狀腺癌細胞SW579凋亡的影響，并分析其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

甘草次酸購買于梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司(產(chǎn)品標號：S0988，HPLC ≥98%)；SW579購買于中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎研究所；DMEM細胞培養(yǎng)液購買于美國Gene公司；胰酶和Hyclone小牛血清購買美國Thermo scientific公司；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購買于美國BD公司； PI3K、AKT、p-AKT、β-actin一抗買于美國Santa Cruze生物技術(shù)公司；其余分析純試劑購買于國藥集團北京分公司。低速離心機購買于湖南湘儀儀器裝備有限公司；FACSCalibur流式細胞儀購買于美國BD公司；CO2培養(yǎng)箱購買于美國Thermo公司；550酶標儀和垂直系列電泳槽購買于美國Bio-Rad公司。

1.2 甲狀腺癌細胞SW579的體外培養(yǎng)

將融合度為90%的甲狀腺癌細胞SW579用PBS沖洗2次后，加入1.25%的胰酶消化3 min后，加入含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基，將細胞按照2×107密度接種于6孔板中，待細胞貼壁后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，直至細胞的融合度接近90%，棄去上清。將在6孔板內(nèi)培養(yǎng)各組甲狀腺癌細胞SW579消化后1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，PBS清洗2次，加入500 μl的Binding buffer重懸細胞制備單細胞懸液并調(diào)整濃度為1×106cells/ml，取200 μl細胞懸液，加入Annexin V-FITC流式抗體5 μl混勻，再加入5 μl Propidium Iodide，混勻，避光室溫孵育20 min后流式細胞儀檢測細胞凋亡的比例。

1.3 實驗分組與處理

將接種在6孔板的甲狀腺癌細胞SW579分成4組，每組設置5個復孔，對照組為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；低濃度甘草次酸組為含濃度50 μmol/L+ 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；中濃度甘草次酸組為含濃度100 μmol/L+ 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；高濃度甘草次酸組為含濃度200 μmol/L+ 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；各組細胞分別在5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h和48 h后進行指標檢測。

1.4 甲狀腺癌細胞SW579凋亡的監(jiān)測

將在6孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h和48 h的各組甲狀腺癌細胞SW579消化離心后，按照1.2中的方法檢測甲狀腺癌細胞SW579凋亡比例。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測檢PI3K、AKT1、p-AKT蛋白的表達

使用蛋白裂解液將在6孔板內(nèi)培養(yǎng)48 h的各組甲狀腺癌細胞SW579裂解，將裂解產(chǎn)物收集到1.5 ml EP管中，煮沸5 min后通過高速離心機在12 000 r/min離心1 min。BCA法進行蛋白定量，向SDS-PAGE凝膠中加入樣本，電泳分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。加入PI3K(1∶1 000)、AKT1(1∶500)、p-AKT(1∶500)和β-actin(1∶1 000)抗體4℃孵育過夜后，加入二抗在37℃孵育30 min。通過凝膠成像分析系統(tǒng)，并通過各條帶的吸光度值計算蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度甘草次酸對甲狀腺癌細胞SW579凋亡比例的影響

流式細胞儀對凋亡細胞的比例進行檢測，結(jié)果顯示在經(jīng)過甘草次酸孵育24 h后，與對照組相比較，在50 μmol/L甘草次酸組中凋亡細胞比例升高，差異無顯著性(P>0.05)；在100 μmol/L和200 μmol/L甘草次酸組中凋亡細胞比例明顯升高，差異具有顯著性(P<0.05)。經(jīng)過甘草次酸孵育48 h后，在50 μmol/L甘草次酸組中凋亡細胞比例升高，差異無顯著性(P>0.05)；在100 μmol/L和200 μmol/L甘草次酸組中凋亡細胞比例明顯升高，差異具有顯著性(P<0.05，表1)。

Conditions24 h48 hControl61.55±5.4567.16±5.2650 μmol/L GA73.28±6.1980.67±5.17100 μmol/L GA85.47±3.12?89.27±5.61?200μmol/L GA89.98±3.92?94.13±5.47?

*P<0.05vscontrol group

2.2 不同濃度甘草次酸對甲狀腺癌細胞SW579PI3K、AKT1、p-AKT蛋白表達的影響

將經(jīng)過不同濃度甘草次酸孵育48 h的各組甲狀腺癌細胞SW579裂解，檢測各組中PI3K、AKT1、p-AKT蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，50 μmol/L甘草次酸組中的AKT1、p-AKT、PI3K蛋白的相對表達量減少，與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)；100 μmol/L和200 μmol/L甘草次酸組中的AKT1、p-AKT蛋白的表達逐漸減弱，與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)，PI3K蛋白的相對表達量與對照組相比無顯著性差異(P>0.05，圖1，表2)。

Fig.1Expression of PI3K, AKT1 and p-AKT proteins after thyroid cancer cell line SW57 incubated with different concentrations of glycyrrhetinic acid(GA) 48 h

A: Control group; B: 50 μmol/L GA group; C: 100 μmol/L GA group; D: 200 μmol/L GA group

Conditions PI3K AKT1p-AKTControl3.18±0.222.91±0.172.14±0.1350 μmol/L GA3.07±0.122.87±0.112.04±0.08100 μmol/L GA3.08±0.191.69±0.17?1.54±0.09?200 μmol/L GA3.05±0.251.74±0.09?1.31±0.07?

*P<0.05vscontrol group

3 討論

甲狀腺癌作為內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見的腫瘤，其發(fā)病率和病死率都呈迅猛上升態(tài)勢。甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過程極其復雜，探究甲狀腺癌細胞凋亡的分子機制，尋找治療肝癌甲狀腺癌的新藥物具有重要的臨床意義。甘草別名甜草，是一種具有補脾益氣、解毒緩急功效的中草藥。甘草在中醫(yī)藥實踐中應用廣泛，俗稱十藥九草。在神農(nóng)《神農(nóng)本草經(jīng)》中有記載“甘草，主五臟六腑寒邪氣，堅筋骨，長肌肉，倍氣力，金瘡腫，解毒?！备什荽嗡崾歉什莸闹饕行С煞种唬且环N齊墩果烷型五環(huán)三萜化合物，具有抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等藥理學活性[8]。而近年來的研究證明，甘草次酸可以在體外抑制血液腫瘤、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌和食管癌等多種類型的腫瘤細胞的增殖，而對于正常體細胞的毒性較小[6,9]。細胞凋亡是由基因編碼控制的一種主動的生理性死亡過程，是機體維持自身穩(wěn)定的重要途徑之一，而細胞凋亡異常則是腫瘤發(fā)生的重要原因，因此，誘導腫瘤細胞凋亡，是抑制腫瘤發(fā)展的重要方法之一，也是當前臨床腫瘤治療的熱點[10]。既往研究表明，甘草次酸可以通過多種途徑誘導腫瘤細胞凋亡[11-12]。而本研究顯示，甘草次酸對甲狀腺癌具有抑制作用，經(jīng)過100 μmol/L和200 μmol/L甘草次酸孵育24 h、48 h后，甲狀腺癌細胞SW579的凋亡比例均高于對照組，且隨著時間和濃度的增加，甘草次酸的促進凋亡作用呈現(xiàn)出一定的時間和劑量依賴性。由于藥物對甲狀腺癌細胞蛋白質(zhì)的表達需要一定周期，基因表達的改變一般發(fā)生在給藥后的24 h內(nèi)，但是出現(xiàn)蛋白質(zhì)改變一般要晚于基因表達，因此本實驗在48 h后對目的蛋白進行了檢測。實驗細胞均進入指數(shù)增長期融合度為90%左右，因此在對照組中出現(xiàn)了細胞的死亡比例增加的問題，可能與細胞的生長特點有關(guān)，即在短時間細胞因缺乏生長空間和營養(yǎng)物質(zhì)造成死亡率過高，這一是本實驗需要改進的問題。

PI3K/AKT信號通路廣泛存在于真核細胞中，其作為主導細胞生理功能的信號通路之一，廣泛參與細胞的凋亡、細胞氧化性損傷和腫瘤發(fā)生的病理生理過程[13-15]，在甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。PI3K屬于原癌基因編碼蛋白，AKT是PI3K下游的重要靶激酶之一，PI3K 激活能夠在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3，AKT 可與質(zhì)膜上的PIP3結(jié)合并被活化，形成p-AKT。活化后的AKT能夠通過磷酸化多種酶、激酶和轉(zhuǎn)錄因子等下游因子，進而調(diào)節(jié)包括凋亡在內(nèi)的細胞功能[16]。通過有效的抑制AKT信號就能夠促進腫瘤細胞的凋亡，對于腫瘤的輔助治療有著積極的作用。鑒于PI3K /AKT通路在腫瘤細胞凋亡中的重要調(diào)控作用，本研究觀察了甘草次酸對該通路中各信號分子蛋白表達的影響，以探究甘草次酸促進甲狀腺癌細胞SW579凋亡分子機制。

研究結(jié)果顯示，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測PI3K、AKT、p-AKT 在各組中的含量表明，在經(jīng)過甘草次酸孵育48 h后，100 μmol/L和200 μmol/L甘草次酸組的AKT1和p-AKT蛋白的相對表達量較對照組降低；與對照組相比較，50 μmol/L、100 μmol/L和200 μmol/L甘草次酸組的PI3K蛋白的表達量均無差異，提示甘草次酸可能主要是通過抑制下游的Akt蛋白磷酸化來促進甲狀腺癌細胞SW579凋亡。

綜上所述，甘草次酸作為甘草中的有效成分能夠通過抑制AKT蛋白表達，促進甲狀腺癌細胞SW579的凋亡，進而發(fā)揮抗腫瘤效應。甘草次酸來源廣泛，成本低廉，其在腫瘤臨床治療中研發(fā)應用前景廣闊、意義重大。