吳雄健，鄭 虹

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；2.2016級碩士研究生，江西 贛州 341000)

肝纖維化是機體對各種原因所致的慢性肝損傷的修復(fù)反應(yīng)，是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的中間環(huán)節(jié)，其本質(zhì)是機體對慢性肝損傷修復(fù)過程中的代償反應(yīng)。在發(fā)達國家，肝纖維化的主要病因是乙醇濫用、慢性丙型肝炎(HCV)和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)[1]，而在我國則以慢性乙型肝炎為主。肝纖維化可通過戒酒、調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)和減肥及抗病毒等去除病因的方法來治療。然而，絕大多數(shù)肝病難以從根本上去除病因，如乙肝、自身免疫性肝炎等。由于供體的短缺限制了大多數(shù)患者接受肝移植這種失代償肝病公認有效的治療方法[2]。因此，針對肝纖維化的發(fā)病機制，干預(yù)某些發(fā)病環(huán)節(jié)，成為纖維化治療的有效手段。

1 材料和方法

1.1實驗動物健康雄性SD大鼠48只，贛南醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所提供[許可證號：SCXK(贛)2014-0001]，體重(200±20) g。

1.2主要實驗試劑丹酚酸A標準品(成都德銳可生物科技有限公司，純度>95%)，CCL4(麥克林生化科技有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher)。α-SMA 兔抗鼠多克隆一抗(碧云天生物技術(shù))，TGF-β1、Smad3兔抗鼠單克隆一抗(英國Abcam公司)，辣根過氧化酶標記山羊抗兔IgG(碧云天生物技術(shù))。

1.3方法

1.3.1造模及給藥隨機將48只大鼠分為對照組(N)、模型組(M)、丹酚酸A組(S)和TGF-β1+丹酚酸A組(T)，各12只。除了對照組以外，其余大鼠均以花生油稀釋的40%的CCL4溶液(3 mL·kg-1)皮下注射,每周2次，共8周。對照組注射等量生理鹽水。造模完成后，丹酚酸A組和TGF-β1+丹酚酸A組腹腔注射丹酚酸A 10 mg·(kg·d)-1和TGF-β15 μg·(kg·d)-1+丹酚酸A 10 mg·(kg·d)-1，共6周。6周后處死大鼠取肝組織。一部分用10%的甲醛固定后留備后續(xù)制作石蠟切片，另一部分則保存于-70 ℃冰箱中，用于后續(xù)的分子生物學(xué)檢測。

1.3.2 HE染色在組織塊經(jīng)過固定后，常規(guī)進行石蠟包埋、切片。對切片進行HE染色。根據(jù)Ishak評分對各組大鼠的纖維化程度進行評分。0分：無纖維化改變；1分：少數(shù)匯管區(qū)域的纖維增生，伴或不伴纖維間隔；2分：多數(shù)匯管區(qū)域的纖維增生，伴或不伴纖維間隔；3分：多數(shù)匯管區(qū)域的纖維增生，偶見匯管區(qū)的纖維橋連；4分：匯管區(qū)域的纖維增生伴明顯的纖維橋連(匯管-匯管之間及匯管-中央靜脈之間)；5分：明顯的橋接纖維化(匯管-匯管之間及匯管-中央靜脈之間)，偶爾可見肝硬化結(jié)節(jié)(不完全硬化)；6分：可能或明確的肝硬化。

1.3.3RT-PCR

1.3.3.1肝組織總RNA的提取取60 mg肝組織，加1 mL的Trizol勻漿后冰上放置5 min；加200 μL的氯仿，震蕩混勻30 s后冰上靜置4 min，離心15 min(4 ℃、12 000 rpm)；取上層的無色水相加等體積異丙醇混勻室溫放置15 min，離心15 min(4 ℃、12 000 rpm)；棄上清，加1 mL 75%的乙醇混勻后離心5 min(4 ℃、12 000 rpm)；棄上清后晾干2～3 min；加DEPC水使RNA能夠充分溶解；用酶標儀檢測RNA純度。

1.3.3.2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照TIANGEN公司FastQuant RT Kit(with gDNase)試劑盒說明書操作，建立逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系。將5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×Fast RT Buffer、RNase-Free dd H2O及樣品RNA置于冰上。gDNA去除反應(yīng)體系是按說明書配置并混勻，瞬時離心，42 ℃，孵育3 min，冰上放置。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的混合液加入到gDNA去除反應(yīng)體系中并混勻，42 ℃，孵育15 min，95 ℃，孵育3 min，置于冰上或-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.3RT-PCR溶解2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix、cDNA模板，α-SMA、TGF-β1、Smad3、β-actin基因引物和RNase-Free dd H2O。在冰上配置Real Time PCR反應(yīng)體系，標記八連管后短暫離心，放于PCR儀中，進行反應(yīng)。對α-SMA、TGF-β1、Smad3和β-actin基因相對表達量進行計算，進而得到目的基因的相對表達量。

1.3.4 Western Blot檢測各組目的蛋白表達情況

1.3.4.1肝組織總蛋白的提取取肝組織20 mg用剪刀剪碎。加200 μL含有PMSF的裂解液后勻漿。幾分鐘后重復(fù)勻漿盡量使組織碾碎。置于冰上30 min后離心5 min(4 ℃、12 000 rpm)。取上清，使用Pierce?BCA Protein Assay Kit試劑盒檢測蛋白濃度。

1.3.4.2 Western Blot方法檢測各組目的蛋白表達情況根據(jù)蛋白濃度，每孔上樣50 μg蛋白。蛋白樣品與6×蛋白上樣緩沖液以5∶1的比例混合，100 ℃，10 min使蛋白變性。配置12%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣后開始電泳(80 V)，然后恒流轉(zhuǎn)膜200 mA，時間60 min。封閉液封閉1 h，一抗：α-SMA(1∶300)，TGF-β1(1∶1 000)，Smad3(1∶5 000)，4 ℃過夜，二抗：1∶1 000，1 h。β-actin作為內(nèi)參?；瘜W(xué)發(fā)光后，在成像系統(tǒng)中曝光。

2 結(jié) 果

2.1肝臟大體形態(tài)觀察皮下注射CCL4后的大鼠精神萎靡，攝入減少，活動量減少。肉眼可見所取得的對照組大鼠肝臟表面平滑，質(zhì)軟，呈紅褐色，模型組大鼠肝臟表面有顆粒狀凹凸不平，觸之有韌性，呈黃褐色，部分可見腹腔積液。丹酚酸A組大鼠肝臟表面較光滑，質(zhì)地較柔軟，較少出現(xiàn)腹腔積液，TGF-β1+丹酚酸A組大鼠與模型組大鼠相似，部分大鼠可見腹腔積液。

2.2肝臟組織病理學(xué)觀察HE染色后對照組大鼠組織標本可見肝小葉完整，肝細胞圍繞中央靜脈向周圍放射狀排列，分布規(guī)則。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)明顯改變，肝組織內(nèi)可見大量脂滴，可見炎性細胞浸潤在門靜脈和中央靜脈周圍，細胞外基質(zhì)增生明顯，纖維間隔較長，且部分形成早期肝硬化的大小結(jié)節(jié)。丹酚酸A組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)改善明顯，炎性細胞浸潤減輕，壞死程度降低。TGF-β1+丹酚酸A組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)改變明顯，肝組織內(nèi)存在大量脂滴，且可見炎性細胞浸潤在門靜脈和中央靜脈周圍，細胞外基質(zhì)增生明顯，細胞間纖維間隔增加(圖1)。

圖1 各組大鼠肝臟細胞HE染色(40×)

2.3肝臟纖維化評分各組大鼠肝纖維化程度分級見表1，結(jié)果可見，對照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，模型組肝纖維化改變明顯，丹酚酸A組與模型組相比肝纖維化程度明顯改善(P<0.05)，與模型組比較，TGF-β1+丹酚酸A組肝纖維化程度無明顯差異。

表1 各組肝臟纖維化評分

注：與對照組比較，*P<0.05；S組與M組相比，T組與S組相比，#P<0.05。

2.4 RT-PCR檢測細胞中α-SMA、TGF-β1、Smad3mRNA的表達模型組、丹酚酸A組及TGF-β1+丹酚酸A組中α-SMA mRNA的相對表達量明顯高于對照組(P<0.05)。與模型組相比，丹酚酸A組α-SMA mRNA的表達量降低(P<0.05)。TGF-β1+丹酚酸A組α-SMA mRNA表達量與模型組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與丹酚酸A組比，TGF-β1+丹酚酸A組α-SMA mRNA表達量增高(P<0.05)。模型組、丹酚酸A組及TGF-β1+丹酚酸A組TGF-β1mRNA的相對表達量明顯高于對照組(P<0.05)。丹酚酸A組TGF-β1mRNA的表達量比模型組大鼠降低明顯(P<0.05)。TGF-β1+丹酚酸A組TGF-β1mRNA表達量與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與丹酚酸A組相比，TGF-β1+丹酚酸A組TGF-β1mRNA表達量明顯增高(P<0.05)。模型組、丹酚酸A組及TGF-β1+丹酚酸A組Smad3 mRNA的相對表達量比對照組升高明顯(P<0.05)。丹酚酸A組大鼠Smad3 mRNA的表達量比模型組低(P<0.05)。TGF-β1+丹酚酸A組Smad3 mRNA的表達量與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與丹酚酸A組比，TGF-β1+丹酚酸A組Smad3 mRNA的表達量增高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肝細胞中mRNA的相對表達量

注：與對照組比較，*P<0.05；S組與M組相比，T組與S組相比，#P<0.05。

2.5 Western Blot法檢測各組細胞中α-SMA、TGF-β1、Smad3的蛋白表達模型組、丹酚酸A組和TGF-β1+丹酚酸A組α-SMA蛋白的相對表達量比對照組明顯增高(P<0.05)。與模型組比，丹酚酸A組α-SMA蛋白的相對表達量降低(P<0.05)。TGF-β1+丹酚酸A組α-SMA蛋白的相對表達量與模型組大鼠相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與丹酚酸A組比，TGF-β1+丹酚酸A組α-SMA蛋白的相對表達量增高(P<0.05)。模型組、丹酚酸A組和TGF-β1+丹酚酸A組TGF-β1蛋白的相對表達量比對照組高(P<0.05)。丹酚酸A組TGF-β1蛋白的相對表達量比模型組低(P<0.05)。TGF-β1+丹酚酸A組TGF-β1蛋白的相對表達量與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與丹酚酸A組比，TGF-β1+丹酚酸A組TGF-β1蛋白的相對表達量增高(P<0.05)。模型組、丹酚酸A組和TGF-β1+丹酚酸A組Smad3蛋白的相對表達量比對照組高(P<0.05)。丹酚酸A組Smad3蛋白的相對表達量比模型組低(P<0.05)。TGF-β1+丹酚酸A組Smad3蛋白的相對表達量與模型組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與丹酚酸A組比，TGF-β1+丹酚酸A組Smad3蛋白的相對表達量增高(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組大鼠細胞中蛋白的相對表達量

注：與對照組比較，*P<0.05；S組與M組相比，T組與S組相比，#P<0.05。

圖2 各組大鼠細胞中蛋白電泳圖

3 討 論

肝纖維化是在各型肝炎病毒感染、酒精和脂肪性肝病、膽汁和自身免疫性肝病后發(fā)生的一種肝損傷后的慢性修復(fù)反應(yīng)。其本質(zhì)是ECM的過度沉積和HSCs的活化[3]。目前認為，肝纖維化發(fā)展的核心在于HSCs的激活[4-6]?；罨腍SCs的主要特征包括HSCs的增殖和HSCs內(nèi)α-SMA的表達[7-8]?；罨腍SCs不僅可以自分泌大量生長因子促進自身增殖和膠原分泌，還可以分泌MMPs和TIMPs等。ECM的動態(tài)平衡有賴于MMP及TIMP之間的動態(tài)平衡，ECM的生成與降解失衡是肝纖維化發(fā)生的最主要原因[9-12]。

目前已知，TGF-β1/Smad信號通路與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。TGF-β1/Smad信號通路現(xiàn)已明確可以刺激HSCs的活化進而轉(zhuǎn)化為MFB，在HSCs活化早期刺激ECM的合成與沉積。HSCs活化后也可分泌TGF-β1，使其在體內(nèi)的表達量增高。TGF-β包括許多亞型，在脊椎動物中分為TGF-β、活動素(activin)和骨成型蛋白(BMPs)[13]；在哺乳動物中則分為TGF-β1、TGF-β2和TGF-β33種，TGF-β1在肝臟中的含量最高[14]。正常情況下肝臟中TGF-β1的表達量很少，主要在Kupffer細胞、儲脂細胞等細胞中產(chǎn)生。當致病因子作用時TGF-β1會大量合成和分泌[15]。在肝纖維化的形成過程中，TGF-β1是一種促纖維化的細胞因子[16]，其下游的胞內(nèi)信號分子是Smad蛋白，它是TGF-β1信號通路中重要的胞內(nèi)激酶的底物。當TGF-β1信號通路激活后，可通過Smad蛋白調(diào)控膜受體到核內(nèi)基因信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。Smad蛋白包括至少8個亞型，可分為3大類：第一類是膜受體激活的Smad(R-Smad)，R-Smad主要包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8。第二類是通用的Smad(Co-Smad)，Co-Smad目前只包含Smad4。第三類則是抑制性Smad(I-Smad)，I-Smad包括Smad6、Smad7，這類Smad蛋白是TGF-β信號通路的抑制因子[17-18]。活化的HSCs可刺激體內(nèi)TGF-β1的分泌，當TGF-β1/Smad信號通路激活后，使胞內(nèi)R-Smad(Smad2、Smad3和Smad4)激活并發(fā)生磷酸化，此時它將從胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，其在核內(nèi)的作用可促使TIMPs、各類膠原纖維表達增加，從而破壞ECM的動態(tài)平衡。MMPs對ECM的降解具有重要作用，TGF-β1/Smad信號通路激活后，一方面加快了肝纖維化的進程，另一方面可激活HSCs并轉(zhuǎn)化為MFB，從而使TIMPs的合成增加，抑制MMPs的作用，使ECM的產(chǎn)生增加，導(dǎo)致肝纖維化的形成。本實驗中丹酚酸A組的α-SMA、TGF-β1和Smad3 mRNA和蛋白的表達量均降低，從而降低了CCL4所致的肝纖維化的程度，保護了肝臟組織。而在TGF-β1+丹酚酸A組中，雖然有丹酚酸A致纖維化的延緩作用，然而，TGF-β1作為外源性的TGF-β1/Smad信號通路的激活因子，促進了信號通路激活后的致纖維化作用，因此，丹酚酸A在TGF-β1+丹酚酸A組中的治療作用不顯著。通過本實驗研究表明丹酚酸A可以通過抑制TGF-β1/Smad信號通路達到緩解肝纖維化發(fā)展的作用。

本實驗研究結(jié)果表明，丹酚酸A可以通過抑制TGF-β1/Smad信號通路來發(fā)揮延緩大鼠肝纖維化進展的生物學(xué)作用。