熒光法測定水中葉綠素a的影響因素分析

鞏元帥 宋靜靜2 古小超

(1.天津市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，天津 300191；2.天津市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院，天津 300191)

富營養(yǎng)化是國內(nèi)河流湖泊普遍面臨的主要環(huán)境問題，對藻類等浮游植物生長及藻華暴發(fā)具有重要的影響[1]。葉綠素a是藻類等浮游植物光合作用色素，是表征水體中浮游植物生物量的重要監(jiān)測指標(biāo)之一，廣泛應(yīng)用于河流湖泊水質(zhì)評價和富營養(yǎng)化評價。目前葉綠素a 的測定方法有熒光法、分光光度法、高效液相色譜法、遙感法等，其中分光光度法是國內(nèi)測定葉綠素a的標(biāo)準(zhǔn)方法，該方法測定簡單，但人工提取葉綠素和測定過程較為繁瑣[2]。與分光光度法相比，熒光法可以不受采樣時間和地點的限制，消除取樣、保存、測量過程中人為因素的影響，可實現(xiàn)現(xiàn)場大批量、連續(xù)快速測定葉綠素a的含量[3]。目前，在湖泊、海洋水質(zhì)在線監(jiān)測中，基于熒光法的葉綠素a監(jiān)測儀應(yīng)用較為廣泛。

1 熒光法基本原理

葉綠素是一種酯類化合物，是由葉綠酸和甲醇、葉醇酯化反應(yīng)而生成。葉綠素作為一種熒光物質(zhì)，受光照后，其分子吸收了和它特征頻率相一致的光，躍遷到能量較高的激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，返回能量較低的基態(tài)時，釋放相應(yīng)的能量產(chǎn)生熒光。當(dāng)葉綠素a經(jīng)波長為450nm左右的藍(lán)光照射后，會激發(fā)出波長為680nm左右的紅光，通過檢測激發(fā)光的熒光強(qiáng)度，來計算葉綠素a的含量[4]。

2 熒光法影響因素

2.1 外界環(huán)境因素的影響

2.1.1 濁度

熒光法是通過測定水樣經(jīng)過光照后產(chǎn)生熒光的強(qiáng)度計算葉綠素a的濃度。水樣中顆粒物、懸浮物等物質(zhì)會影響光在水樣中的傳播，使激發(fā)光和熒光發(fā)生反射、散射等，對熒光測定結(jié)果造成影響。研究表明，濁度對葉綠素a測定的影響主要分為懸浮物自身產(chǎn)生熒光的熒光效應(yīng)及對光線遮擋的遮蔽效應(yīng)，兩者均會對熒光測定結(jié)果產(chǎn)生影響[5]。葉陳軍等[3]探討了熒光效應(yīng)和遮蔽效應(yīng)對測定結(jié)果的影響，并根據(jù)實測數(shù)據(jù)提供一種葉綠素?zé)晒庥嫽跐岫鹊男拚椒?，校?zhǔn)后的熒光值與真實葉綠素?zé)晒庵递^為接近。

2.1.2 pH值

pH值是藻類生長過程中最重要的影響因子之一，pH值對微藻細(xì)胞生長和油脂積累的影響主要在于改變細(xì)胞膜電荷和營養(yǎng)物的離子化程度，進(jìn)而改變細(xì)胞的活性。 水體中過酸過堿的環(huán)境條件會干擾藻類細(xì)胞對物質(zhì)的吸收，影響其生長代謝活性及葉綠素產(chǎn)量，對熒光特性產(chǎn)生一定的影響。呂鵬翼[4]在研究pH值對葉綠素現(xiàn)場檢測儀測定結(jié)果影響中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值在中性范圍內(nèi)時，銅綠微囊藻測定值變化較小，酸性或堿性測定誤差增大。薄香蘭等[6]以小球藻為研究對象，研究不同pH值對其葉綠素?zé)晒狻⑷~綠素含量和細(xì)胞密度的影響，結(jié)果表明pH值為7時，熒光活性最高，pH值為9時，熒光活性下降。

2.1.3 水溫

熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度受溫度影響較大。當(dāng)溫度降低時，熒光物質(zhì)分子躍遷吸收的能量越高，回到基態(tài)時，釋放的熒光量子越高，熒光強(qiáng)度越高；溫度升高時則相反[7]。藻類等浮游植物自身受環(huán)境溫度影響較大，當(dāng)溫度變化時，活體藻結(jié)構(gòu)、光合速率或葉綠體的微環(huán)境發(fā)生了改變，從而影響了葉綠素a的熒光特性。呂鵬翼等[8]研究了溫度對斜生柵藻、蛋白核小球藻及銅綠微囊藻熒光強(qiáng)度的影響，并計算了溫度系數(shù)，結(jié)果表明隨著溫度升高，3種活體藻熒光強(qiáng)度均下降。

2.1.4 水樣濃度

熒光法測定溶液物質(zhì)含量時，在一定濃度范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度與溶液濃度成正比，可根據(jù)熒光強(qiáng)度換算出溶液中熒光物質(zhì)的含量，對于濃度較高的溶液，熒光強(qiáng)度與濃度不成線性關(guān)系。當(dāng)溶液濃度過高時，一方面會導(dǎo)致激發(fā)光透光性減弱，另一方面會發(fā)生熒光自猝滅和熒光再吸收現(xiàn)象，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低[7]。所以，在利用熒光法現(xiàn)場測定水體中葉綠素a的濃度時，在藻類濃度較高時，需適當(dāng)進(jìn)行稀釋處理。

2.1.5 其他色素

在藻類等浮游植物葉綠素分子中，除了葉綠素a，還存在葉綠素b和葉綠素c。其中葉綠素a和葉綠素b在化學(xué)性質(zhì)上具有一定的相似性，兩者的激發(fā)和發(fā)射光譜存在明顯的重疊。因此，在利用熒光法現(xiàn)場測定水體中葉綠素a的濃度時，需對測定的熒光強(qiáng)度進(jìn)行修正，扣除葉綠素b所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。為提高測量精度，許多專家學(xué)者利用同步熒光法測定葉綠素a含量，研究表明，測定結(jié)果基本不受其他色素干擾。

2.2 擬合模型

熒光法測定水體中葉綠素a，一般采用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法進(jìn)行計算，該方法簡單，對于水質(zhì)干凈、常年變化穩(wěn)定的水體，能較好地反映出熒光強(qiáng)度與葉綠素a濃度之間的關(guān)系。但在實際應(yīng)用中工作曲線并非完全是線性的，對于復(fù)雜的水體，線性擬合會導(dǎo)致測定結(jié)果出現(xiàn)較大誤差。因此，為解決這類問題，將偏最小二乘法、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、支持向量回歸等方法應(yīng)用到模型擬合中。但這些方法計算較為復(fù)雜，在擬合過程中需要較多的測量數(shù)據(jù)，建立過程比較繁瑣。

2.3 運(yùn)行維護(hù)

在水質(zhì)自動監(jiān)測中，采用熒光法的葉綠素a在線監(jiān)測儀進(jìn)行監(jiān)測，具有測定快捷、維護(hù)簡單等特點，適用于飲用水、海洋葉綠素a的監(jiān)測。但受水體中微生物影響，儀器表面容易附著浮游植物及動物，受其生命活動影響，會加速儀器老化，導(dǎo)致生物腐蝕 ，影響儀器測量的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。在對儀器的日常維護(hù)工作中，根據(jù)運(yùn)行要求，工作人員應(yīng)及時清理儀器表面附著的微生物，使儀器保持干凈。定期對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，開展實驗室比對，確保儀器穩(wěn)定運(yùn)行。當(dāng)發(fā)現(xiàn)儀器損壞時及時進(jìn)行更換備件，保證監(jiān)測數(shù)據(jù)的連續(xù)性和完整性。

3 結(jié) 語

熒光法在水質(zhì)較好的水體中測定結(jié)果較為準(zhǔn)確，當(dāng)水質(zhì)較差時，由于影響因子較多，熒光法測定誤差則會增大。為減小環(huán)境因子對監(jiān)測儀器的影響，應(yīng)做好以下工作：?加強(qiáng)監(jiān)測儀器維護(hù)，尤其在夏季，保持儀器表面清潔干凈；?采用溫度補(bǔ)償、濁度補(bǔ)償?shù)确绞?，消除水溫變化、懸浮顆粒等對葉綠素a測定結(jié)果的影響；?利用同步熒光等對測試方法進(jìn)行優(yōu)化，扣除葉綠素b對測定結(jié)果的影響；?在擬合模型建立過程中，對比研究偏最小二乘法、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、支持向量回歸等方法在葉綠素測定中的應(yīng)用，提高計算結(jié)果準(zhǔn)確度。

利用熒光法可快速實現(xiàn)水體中葉綠素a含量的測定，與實驗室分光光度法相比，操作簡單、時效性強(qiáng)，可節(jié)省人力、物力。隨著地表水資源、海洋環(huán)境保護(hù)力度的不斷加強(qiáng)，水體富營養(yǎng)化監(jiān)測工作將愈加重要，熒光法在葉綠素a測定中的應(yīng)用將越來越廣泛。