岳筠2李鳳龍

(1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴州省動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550008；4.遵義市紅花崗區(qū)海龍鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務中心，貴州 遵義 563099)

雞安卡拉病是由禽腺病毒Ⅰ群C種血清4型(FAdV-4)引起的以心包積液、肝臟腫大出血為主要特征的疾病，又稱心包積液-肝炎綜合癥。該病最早于1987年發(fā)生在巴基斯坦卡拉奇市附近的安卡拉地區(qū)，因此稱為安卡拉病，并很快蔓延到整個巴基斯坦地區(qū)[1，2]。此后世界上很多國家(如印度、韓國、美國等)相繼暴發(fā)此病，造成了嚴重的經(jīng)濟損失[3]。安卡拉病毒粒子無囊膜，其主要結(jié)構(gòu)蛋白有Hexon、Penton、Fiber1和Fiber2，而Fiber1和Fiber2為2種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，具有型和亞群特異抗原決定簇[4]；病毒粒子具有252殼粒，其中二十面體的頂角殼粒為12個五鄰體(penton)；五鄰體和纖突的頭節(jié)區(qū)可與細胞表面的病毒受體結(jié)合，這在病毒感染細胞過程中起著非常重要的作用；二十面體上還有240個非頂角殼粒，稱為六鄰體(hexon)，其攜帶的抗原決定簇是中和抗體的靶標[5]。FAdV-4與FAdV-8b、包涵體肝炎病毒均能引起相似的臨床癥狀，特別是肝臟的病變，在臨床診斷時極易混淆[6]。為了快速鑒別并及時制定有效的防控措施，對雞安卡拉病進行實驗室快速準確診斷十分重要。2012年該病在我國山東、河北的養(yǎng)殖雞群中出現(xiàn)[7]。2015年以來，在山東、河南、廣東等地區(qū)呈暴發(fā)性流行，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[8]。2016年底，貴州省多地也發(fā)現(xiàn)疑似病例。本研究對貴州省某養(yǎng)雞場發(fā)生的疑似安卡拉病毒感染病例進行實驗室診斷和禽腺病毒基因分型鑒定，以確定病原種類和血清型，為貴州省安卡拉病的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料采集貴州省某規(guī)?；B(yǎng)雞場病雞肝臟作為檢測分析病料。

1.2 試劑DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR擴增試劑、限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xhol、DL 2 000 Marker、pMD19-T載體等，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設計與合成根據(jù)GenBank公布的安卡拉病毒基因序列信息，設計合成Fiber1特異性引物核苷酸序列，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。序列信息見表1。

表1 引物信息

1.4 FAdV-4 PCR 檢測應用DNA提取試劑盒對臨床病例的肝臟組織樣本進行總DNA提取，建立PCR反應體系25.0 μL：2-TaqPCR mastermix 12.5 μL，引物Fiber1R和Fiber1F各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，滅菌ddH2O 8.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，取PCR產(chǎn)物10 μL于含Goldview核酸染料的1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像儀上觀察結(jié)果。

1.5 目的基因測序及序列分析安卡拉病毒Fiber1基因PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、膠回收純化后，進行目的基因測序，與參考毒株進行序列分析，確定病毒流行株基因分型。參考序列見表2。

表2 FAdV-4參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測結(jié)果應用基于安卡拉病毒Fiber1基因特異性引物對臨床病料組織樣本總DNA進行目的基因PCR擴增，結(jié)果見圖1。病例肝臟組織樣本總DNA中擴增出大小約1 296 bp特異性條帶，與預期擴增片段大小相符。

圖1 PCR檢測結(jié)果M：DL 2 000 Marker；1：陽性對照；2～3：檢測樣本；4：陰性對照

2.2 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果將PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳純化后進行基因測序，測序序列見圖2。PCR擴增目的基因大小確定為1 296 bp，與預期擴增Fiber1基因片段大小完全相符，毒株暫命名為：GZ-LPS。

圖2 目的基因測序結(jié)果

2.3 目的基因核苷酸序列同源性分析結(jié)果應用DNAStar軟件將Fiber1基因核苷酸序列與GenBank中參考毒株進行序列對比發(fā)現(xiàn)，本試驗檢測毒株與河北、江蘇、河南等國內(nèi)禽腺病毒Ⅰ群血清4型(FAdV-4)分離株同源性達99.8%以上，與國內(nèi)FAdV-11分離株HBQ11同源性僅為23.2%。與國外的禽腺病毒血清4型分離株比較顯示：與巴基斯坦分離株K31的同源性高達99.9%；與墨西哥分離株MX-SHP95、加拿大分離株ON1同源性達95.0%以上；與國內(nèi)外FAdV-2、FAdV-8、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-11的禽腺病毒核苷酸同源性為23.2%～28.9%。見圖3。

圖3 目的基因核苷酸序列同源性比較

2.4 基因序列系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果應用MegAlign軟件對FAdV-4貴州流行株GZ-LPS的Fiber1基因序列與國內(nèi)外參考毒株Fiber1基因序列進行系統(tǒng)進化樹分析。結(jié)果顯示：本病例中的安卡拉病毒流行株GZ-LPS與國內(nèi)河北、江蘇等地FAdV-4分離株以及國外的FAdV-4分離株K31、MX-SHP9、ON1處于同一進化分支，而與國內(nèi)外的FAdV-2、FAdV-8、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-11處于不同進化分支。見圖4。

圖4 目的基因序列系統(tǒng)進化分析

3 討論

雞安卡拉病的診斷目前以病毒的分離培養(yǎng)與鑒定、血清學鑒定和基于特異性基因的分子生物學鑒定為主，其中病毒分離鑒定多用于病毒學研究，但存在周期長、效率低等問題，而血清學鑒定對腺病毒眾多血清型進行區(qū)分也存在特異性不高的問題，因此基于特定基因的分子生物學鑒定方法被廣泛應用[9，10]。禽腺病毒根據(jù)抗原性的不同分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群，Ⅰ群禽腺病毒又分為A、B、C、D、E 5個種和12個血清型(FAdV-1-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9-11)，可見禽腺病毒種類繁多，依賴于傳統(tǒng)的血清學分型技術(shù)需要大量的特異性抗體，成本高、效率低，而依賴于基因測序與序列分析的基因分型技術(shù)在禽病毒分類中已被廣泛應用[11～13]。貴州省對本病的報道資料較少，為實現(xiàn)病例的快速診斷與及時處置，本研究開展了基于安卡拉病毒Fiber1基因分型的分子生物學鑒定，為實現(xiàn)安卡拉病毒的快速診斷及早發(fā)現(xiàn)、早治療提供基礎參考依據(jù)。

4 結(jié)論

通過對貴州某養(yǎng)雞場病例進行實驗室診斷和禽腺病毒基因分型鑒定，確診為安卡拉病毒感染，分離毒株命名為“貴州株GZ-LPS”，與國內(nèi)外FAdV-4參考株基因同源性高達99.0%以上，而與其他血清型基因同源性均較低。進化樹分析顯示該毒株與FAdV-4參考株親緣關(guān)系最近，確定為禽腺病毒Ⅰ群 C種血清4型毒株。