嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲幼蟲的室內致死能力測定

鐘寶珠　呂朝軍　李朝緒　閻偉　黃山春　覃偉權

摘 ?要：為探討利用昆蟲病原線蟲嗜菌異小桿線蟲H06品系防治紅棕象甲的可行性，在室內研究了該線蟲對紅棕象甲幼蟲的致死效果和毒力水平。采用微量點滴法測試線蟲不同施藥劑量和施藥時間對紅棕象甲3齡幼蟲的致病效果，并觀察處理后紅棕象甲幼蟲的形態(tài)學特征變化。嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲具有一定的致死作用，隨著線蟲接種劑量的增加，紅棕象甲死亡率增加;毒力測定結果顯示，隨著處理時間的延長，紅棕象甲幼蟲的LD50呈現(xiàn)降低的趨勢，同時隨線蟲接種劑量的提高，LT50逐漸縮短;形態(tài)學觀察結果顯示，紅棕象甲幼蟲被嗜菌異小桿線蟲H06品系感染后，蟲體呈現(xiàn)出僵硬皺縮、體色變褐、身體腫脹直至最后蟲體腐爛、線蟲游離而出的現(xiàn)象。實驗結果表明，嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲低齡幼蟲具有一定的防控潛力。

關鍵詞：昆蟲病原線蟲;嗜菌異小桿線蟲H06品系;紅棕象甲;致病力;毒力

中圖分類號：S433.5;S476.1 ? ? ?文獻標識碼：A

Determination of Lethal Ability of Heterorhabditis bacteriophora H06 Strain Against the Larvae of Red Palm Weevil Rhyncophorus ferrugineus in Laboratory

ZHONG Baozhu， LYU Chaojun*， LI Chaoxu， YAN Wei， HUANG Shanchun， QIN Weiquan*

Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / National Engineering Research Center of Coconut， Wenchang， Hainan 571339， China

Abstract： To explore the feasibility of controlling Rhyncophorus ferrugineus using entomopathogenic nemotode Heterorhabditis bacteriophora H06 strain， the lethal effect and virulence level of entomopathogenic nemotode on the larvae of red palm weevil were tested in laboratory. The pathogenicity of different dosage and exposure time of H. bacteriophora H06 against 3rd instar larvae of red palm weevil were determined by the micro-drop method， and the morphological characteristics of the infected larvae were also observed. H. bacteriophora H06 strain had a certain lethal effect to the 3rd instar larvae of R. ferrugineus. With the increase of nematode inoculation dosage， the mortality rate of red palm weevil increased. Toxicity test results showed that LD50 value decreased with the exposure time. Meanwhile， with the increase of nematode inoculation dosage， the LT50 of red palm weevil larvae decreased gradually. Morphological observation showed that the infected larvae of the red palm weevil showed a process of sriffness， shrikage， browning， swelling and finally decay， and nematode was free from the larvae. The above result indicated that the nemotode strain H. bacteriophora H06 strain had some control effect on the lower instar larvae of R. ferrugineus in laboratory.

Keywords： entomopathogenic nematode; Heterorhabditis bacteriophora H06 strain; Rhyncophorus ferrugineus; virulence; toxicity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.11.0021

紅棕象甲（Rhyncophorus ferrugineus）是我國重要的林業(yè)檢疫害蟲[1]，也是國際上重要的棕櫚害蟲[2]，對棕櫚植物（椰子、油棕、椰棗等）具有致死性高、危害性大、前期危害癥狀不顯著等特點[3]。目前我國對于該蟲的防治主要以信息素誘集、莖干藥劑注射等為主，其中信息素誘集雖然可以降低成蟲基數(shù)，但對于莖干內危害的幼蟲無效，而藥劑莖干注射法可殺死樹干內的幼蟲，卻會對植株形成傷害并有農(nóng)藥殘留的風險。

昆蟲病原線蟲是一類重要的生物防治資源[4]，它具有寄生性，可侵入健康幼蟲、蛹或成蟲體腔，并殺死多種害蟲[5-7]。昆蟲病原線蟲一旦進入蟲體，就會釋放出消化道內的共生細菌，引起寄主敗血癥使寄主死亡[8-9]。線蟲幼蟲以寄主組織為食物，在蟲尸內生活兩到三代后侵染期線蟲從死亡的昆蟲體內遷移出來，尋找新的寄主[10]。對那些棲境隱蔽、殺蟲劑不易作用到的地下害蟲、鉆蛀害蟲，昆蟲病原線蟲有著其他防治手段所不可比擬的優(yōu)勢[11]。本文針對紅棕象甲幼蟲具有在樹干內危害隱蔽的特性，結合昆蟲病原線蟲的寄生習性，在室內研究了嗜菌異小桿線蟲（Heterorhabditis bacteriophora）H06品系對紅棕象甲幼蟲的致死效果和毒力水平，以期為紅棕象甲的生物防治及昆蟲病原線蟲的利用提供技術支持。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試昆蟲病原線蟲：嗜菌異小桿線蟲（H. bacteriophora）H06品系購自河南濟源白云實業(yè)有限公司。線蟲在室內采用大蠟螟（Galleria mellonella）進行活體繁殖，收獲后收集于三角瓶中，靜置待線蟲沉淀于底層后去除上清液，淺水保存于8 ℃保存柜（華美冷藏柜LC2000D）中備用，保存時間不超過20 d。

紅棕象甲幼蟲：采用本實驗室自繁自育的紅棕象甲（R. ferrugineus）3齡幼蟲，接種線蟲前將紅棕象甲試蟲浸泡于75%酒精中10 s后晾干待用。

1.2 ?方法

1.2.1 ?嗜菌異小桿線蟲 H06品系對紅棕象甲的生物活性測定 ?選用3齡感染期線蟲（infective juveniles， IJs），用無菌水稀釋為200、400、600、800、1000 IJs/mL共計5個濃度，以移液槍吸取150 μL線蟲液點滴于蟲體背面，各濃度線蟲液接種于紅棕象甲體背劑量分別為30、60、90、120、150 IJs/頭，處理后將試蟲轉移至30 mm×30 mm×40 mm的養(yǎng)蟲盒中，添加甘蔗塊繼續(xù)單獨培養(yǎng)。以相同量的無菌水處理為對照。處理后24、48、72、96、120 h觀察紅棕象甲死亡情況，以昆蟲針輕觸蟲體無自主反應為死亡標準。每處理接種30頭試蟲，重復3次。

1.2.2 ?嗜菌異小桿線蟲H06品系侵染后紅棕象甲幼蟲的形態(tài)學觀察 ?選取150 IJs/頭線蟲劑量處理后的紅棕象甲幼蟲進行形態(tài)學觀察，從幼蟲死亡開始每48 h觀察記錄1次，連續(xù)觀察3次。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

根據(jù)黃劍等[12]的方法采用Excel統(tǒng)計軟件求出毒力回歸方程及LD50和LT50、95%置信區(qū)間等。LD50值以IJs/頭表示，LT50以小時（h）表示，毒力差異顯著性以LD50或LT50的95%置信區(qū)間是否重疊為標準。

2 ?結果與分析

2.1 ?嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲幼蟲的致死效果

經(jīng)不同劑量嗜菌異小桿線蟲處理后，紅棕象甲幼蟲的死亡率與線蟲劑量和處理時間均呈正相關（圖1）。研究結果表明，在處理后相同時間，隨著線蟲接種劑量的增加，紅棕象甲死亡率增加，以處理后48 h為例，30、60、90、120、150 IJs/頭處理組的紅棕象甲死亡率分別為25.56%、45.56%、55.56%、64.44%、77.78%;處理后120 h，各處理組的死亡率分別為66.67%、68.89%、91.11%、92.22%、97.78%，其中90、120、150 IJs/頭處理組死亡率均超過90%。各劑量處理組中，隨著處理時間的延長，各處理的死亡率均呈上升趨勢，經(jīng)150 IJs/頭劑量處理后24、48、72、96、120 h，紅棕象甲幼蟲死亡率分別為51.11%、77.78%、87.78%、90.00%和97.78%。

2.2 ?嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲幼蟲的毒力水平

處理后不同時間嗜菌異小桿線蟲對紅棕象甲幼蟲的毒力水平如表1所示。結果表明，隨著處理時間的延長，LD50值呈逐漸降低的趨勢。從LD50值的95%置信區(qū)間來看，處理后72、96、120 h之間存在重疊，表明三者之間的毒力水平差異不顯著，但均與24、48 h處理組差異顯著。嗜菌異小桿線蟲對紅棕象甲幼蟲毒力的時間順序

為：120 h、96 h、72 h>48 h>24 h。

不同劑量線蟲處理對紅棕象甲幼蟲的致死時間（LT50）測定結果如表2。結果表明，隨線蟲接種劑量的增加，對紅棕象甲幼蟲的致死時間（LT50）逐漸縮短。每頭紅棕象甲幼蟲接種30、60、90、120、150 IJs/頭線蟲后，紅棕象甲的LT50分別為74.18、64.14、42.49、34.30、24.31 h。95%置信區(qū)間對比結果表明，150 IJs/頭劑量處理后的LT50值顯著低于90、60、30 IJs /頭劑量處理組;120 IJs/頭劑量處理組LT50值也顯著低于60、30 IJs/頭劑量處理組，說明整體上線蟲的接種劑量與對紅棕象甲幼蟲的致死時間呈負相關。

2.3 ?嗜菌異小桿線蟲H06品系侵染紅棕象甲幼蟲的形態(tài)學結果

嗜菌異小桿線蟲H06品系侵染紅棕象甲幼蟲后的形態(tài)學變化如圖2所示。結果表明，線蟲侵染后48 h（圖2B），紅棕象甲幼蟲蟲體出現(xiàn)皺縮僵硬，體色加深，輕壓蟲體后可恢復原狀;侵染后96 h（圖2C）蟲體變褐，部分體壁出現(xiàn)小膿包，輕壓蟲體回彈性較差，散發(fā)出輕微惡臭;侵染后144 h（圖2D），蟲體腫脹嚴重，甚至變成球形，輕壓蟲體無法回彈且易破，有些蟲體破裂組織液外溢，散發(fā)惡臭嚴重，同時在組織液中可分離到線蟲（圖2E）。

3 ?討論

生物防治被認為是有害生物治理中對環(huán)境安全性較高的方法之一。昆蟲病原線蟲作為重要的生物防治資源，近年來越來越受到人們的關注，如滑莎等[13]探討了4種昆蟲病原線蟲對舞毒蛾（Lymantria dispar Linn.）幼蟲的侵染效果，結果顯示，Sc-All和Sf-IGA線蟲均對舞毒蛾幼蟲具有很強的侵染能力;錢秀娟等[14]選用昆蟲病原線蟲Steinernema feltiae 0619 HT品系，以線蟲濃度1000 IJs/mL與低劑量吡蟲啉（10 mg/L）混配，對韭菜異遲眼蕈蚊（Bradysia odoriphaga Yang et Zhang）幼蟲的校正死亡率比單用吡蟲啉更高，表明昆蟲病原線蟲與低劑量吡蟲啉混用，對異遲眼蕈蚊有明顯的增效作用;陳瑞等[15]研究表明，昆蟲病原線蟲制劑對蘿卜地黃曲條跳甲（Phyllotreta striolata Fab.）幼蟲具有較好的防治作用，在蘿卜播后0、15、30 d各施用1次，小區(qū)試驗防效可達75%以上;李根等[16]測定了斯氏線蟲（S. carpocapsae）和異小桿線蟲（H. bacteriophora）共5個品系對小地老虎（Agrotis ypsilon Rottemberg）幼蟲和蛹的致病力，結果表明，5個不同昆蟲病原線蟲品系均對小地老虎幼蟲具有致病力，其中Sc-A11線蟲對小地老虎的致死速度最快。這些研究結果均表明昆蟲病原線蟲在害蟲的生物防治方面具有很高的應用潛力。

在利用昆蟲病原線蟲防治紅棕象甲方面，國外已經(jīng)開展了部分研究。如Santhi等[17]通過遺傳改良技術提升了昆蟲病原線蟲對紅棕象甲幼蟲的搜索能力;Llacer等[18]研究了小卷蛾斯氏線蟲甲殼聚糖制劑對紅棕象甲的小區(qū)防治實驗，表明其對紅棕象甲具有較好的防治效果。Dembilio等[19]通過研究表明，昆蟲病原線蟲在田間對紅棕象甲幼蟲的防治效果與吡蟲啉相當。而國內在這方面的研究報道較少。本研究結果表明，昆蟲病原線蟲嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲幼蟲具有一定的致死效果，且隨著線蟲接種劑量的增加，紅棕象甲的死亡率呈遞增的趨勢，當接種劑量從30 IJs/頭增加到150 IJs/頭時，處理后120 h紅棕象甲幼蟲的死亡率從66.67%提高到97.78%。

毒力數(shù)據(jù)對比結果表明，隨著處理時間的延長，嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲的毒力水平提高，LD50值逐漸降低，其原因可能是由于線蟲通過蟲體表面的氣孔、足基部的薄弱部位等地方侵入，且線蟲在寄主體內需要一定時間才可發(fā)揮作用，因此隨著時間的延長，侵入蟲體內部的線蟲數(shù)量逐漸增加，侵入的線蟲個體通過取食蟲體營養(yǎng)和排出細菌等，引起紅棕象甲死亡數(shù)量的累計增加。同時在各處理中，隨著處理劑量的提高，紅棕象甲的LT50值降低，表明蟲體接種的線蟲越多，侵入蟲體的線蟲數(shù)量相應增多，蟲體死亡時間越短，因此適當提高線蟲的接種濃度可提高其對紅棕象甲的防治效果，且隨著時間的延長，防治效果愈加顯著。

“椰風海韻”是海南的一張名片，椰子、檳榔、大王棕等棕櫚植物在海南大量種植，但近年來這些植物受到紅棕象甲的嚴重危害。本文初步探索了利用昆蟲病原線蟲嗜菌異小桿線蟲H06品系防治紅棕象甲的可能性，符合海南省建設“國際生態(tài)旅游島”的戰(zhàn)略規(guī)劃，有利于促進加快實施海南省的生態(tài)省建設工程和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，同時可為紅棕象甲生防資源的選擇和生物防治技術的制定提供有利支撐。本研究結論是基于室內研究，供試的昆蟲病原線蟲和紅棕象甲均為室內種群，雖然研究結果與田間應用結果可能會有所偏差，但仍可為紅棕象甲生物防治技術的研發(fā)提供很好的技術參考。同時如何將本結果應用到田間，會涉及到線蟲應用器械、使用關鍵期、線蟲劑型的制作等方面，均需進一步研究。

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收稿日期 ?2019-10-16;修回日期 ?2020-01-16

基金項目 ?海南省自然科學基金項目（No. 318MS105）;海南省重大科技計劃項目（No. zdkj201817）;熱帶木本油料創(chuàng)新團隊項目（No. 1630152017010）。

作者簡介 ?鐘寶珠（1981—），女，碩士，副研究員，研究方向：熱帶害蟲綜合防治技術。*通信作者（Corresponding author）：呂朝軍（LYU Chaojun），E-mail：lcj5783@126.com;覃偉權（QIN Weiquan），E-mail：qwq268@163.com。