孫唯夫，劉 佳，金作林

牙周炎是發(fā)生在牙周組織的感染性疾病,主要表現(xiàn)為牙齦炎癥、牙周袋形成、牙槽骨吸收和牙齒松動脫落。牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)是一種可以從牙周組織分離出的間充質(zhì)干細(xì)胞,具有分化成多種細(xì)胞的潛能,包括成骨、成脂、成纖維和成牙骨質(zhì)等譜系的細(xì)胞[1-2]。由于PDLSCs便捷的組織來源和良好的成骨能力,它被視為牙周組織改建和修復(fù)的種子細(xì)胞[3]。然而炎癥微環(huán)境會破壞PDLSCs的多向分化潛能尤其是成骨分化能力[4]。近些年發(fā)現(xiàn)的LncRNA是一類重要的參與炎癥反應(yīng)的非編碼RNA, LncRNA可以在炎癥微環(huán)境下調(diào)控PDLSCs的成骨分化,為利用LncRNA治療牙周炎導(dǎo)致的牙周組織喪失提供了依據(jù)[5]。

1 PDLSCs的生物學(xué)特性

1.1 PDLSCs是牙周組織改建和修復(fù)的關(guān)鍵細(xì)胞

2004年,Seo等利用單細(xì)胞克隆技術(shù),首次從牙周膜分離并命名了 PDLSCs,這類細(xì)胞屬于間充質(zhì)干細(xì)胞[1]。其良好的成骨能力可以修復(fù)因炎癥喪失的牙槽骨,進(jìn)而軟組織附著改建,起到牙周組織修復(fù)的作用[3,6]。干細(xì)胞療法是一種具有很大潛力的牙周組織修復(fù)方法,有廣闊的臨床應(yīng)用前景[7]。Li等成功將人PDLSCs植入裸鼠的牙周組織,并確定了移植后的有效性和安全性[8]。Iwata使用自體來源的PDLSCs膜片對患者進(jìn)行牙周組織缺損的治療,取得顯著效果[9]。這些結(jié)果都說明PDLSCs在牙周組織的功能維持和缺損組織修復(fù)中起到重要的作用。

1.2 炎癥對PDLSCs功能的影響

在PDLSCs增殖分化的過程中,凡影響細(xì)胞微環(huán)境的因素都將破壞PDLSCs的正常功能[10]。在炎癥微環(huán)境中,PDLSCs會失去成骨潛能,即使脫離炎性微環(huán)境,其功能缺失仍然是長期的、不可逆的[4],這與腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α的增高有關(guān)[11]。炎癥中被高度活化的經(jīng)典Wnt通路和核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路以及炎性因子白細(xì)胞介素1(Interleukin-1, IL-1)和IL-6也會抑制炎癥環(huán)境中PDLSCs(iPDLSCs)的成骨分化[12-14]。有學(xué)者正致力于研究同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞治療疾病的可行性,保留拔除的正畸牙和阻生牙,建立PDLSCs細(xì)胞庫以供臨床實(shí)驗(yàn)和治療[9],但目前如何獲得狀態(tài)良好的自體PDLSCs是亟需解決的問題。

2 LncRNA的分子生物學(xué)作用

LncRNA是一類核苷酸序列大于200的非編碼轉(zhuǎn)錄物質(zhì),在維持細(xì)胞和組織穩(wěn)態(tài)中起重要的調(diào)節(jié)作用。LncRNA含有模塊結(jié)構(gòu)域,通過二級結(jié)構(gòu)或堿基配對的方式與蛋白質(zhì)、核酸結(jié)合,與其它物質(zhì)相互作用而調(diào)節(jié)生物體眾多的生理過程,包括X染色體失活、干細(xì)胞多能性和基因組印記等；同時,它也與眾多病理過程有著密切的聯(lián)系,尤其是炎癥反應(yīng)[15-16]。

LncRNA在生長發(fā)育及干細(xì)胞分化中起著重要作用。女性生長發(fā)育的過程中,兩條X染色體中會有一條發(fā)生失活稱為X染色體失活。LncRNA XIST(X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄物)可將組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶募集到X染色體上,導(dǎo)致組蛋白甲基化和一條X染色體的沉默[17]。在多能干細(xì)胞中,反向編碼的LncRNA調(diào)節(jié)臨近基因的轉(zhuǎn)錄,影響多能干細(xì)胞的分化。反向的LncRNA Evx1as促進(jìn)其鄰居基因EVX1的轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)中內(nèi)胚層分化[18]。

LncRNA在免疫細(xì)胞發(fā)育、分化和活化的過程中廣泛表達(dá),其既可以作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,也可以通過影響其它因子來調(diào)節(jié)免疫基因的表達(dá),參與免疫調(diào)節(jié)[19-20]。NF-κB相互作用的LncRNA(LncRNA NKILA)可以抑制血管炎過程中NF-κB/KLF4正反饋回路的活性,起到分子開關(guān)的作用,減輕炎癥反應(yīng)[21]。TNF-α和hnRNPL相關(guān)免疫調(diào)節(jié)LncRNA(LncRNA THRIL)在許多人體組織中表達(dá),它與可變剪切因子特異性結(jié)合異質(zhì)核核蛋白L(hnRNPL)形成THRIL-hnRNPL復(fù)合物,作用于TNF-α的啟動子來調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄,影響炎癥反應(yīng)。同時THRIL的表達(dá)與川崎病(病理表現(xiàn)為全身性血管炎)癥狀的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[22]。綜上所述,LncRNA與眾多的生理過程有密切的聯(lián)系,對炎癥等病理過程也起關(guān)鍵的調(diào)控作用,研究其作用機(jī)制對于牙周病患者的口腔治療具有顯著的臨床意義。

3 LncRNA調(diào)控PDLSCs成骨分化的作用機(jī)制

牙周炎對患者最大的損傷就是牙槽骨喪失,這會加重牙周袋形成甚至造成牙齒松動、脫落,而且牙周炎得以控制后,缺損的牙周組織也無法自行恢復(fù)。部分口腔醫(yī)生現(xiàn)致力于利用PDLSCs的成骨能力修復(fù)牙槽骨,進(jìn)而軟組織附著、改建,恢復(fù)牙周組織正常形態(tài),達(dá)到牙周組織再生的治療目的[7]。LncRNA已被證明對干細(xì)胞成骨分化具有重要影響,兩者的關(guān)系逐漸成為研究的熱門[23]。

3.1 LncRNA調(diào)控正常PDLSCs的成骨分化

PDLSCs是一種間充質(zhì)干細(xì)胞,具有分化成多種細(xì)胞的潛能,在體外培養(yǎng)條件下可以分化為成骨、成脂、成纖維和成牙骨質(zhì)等譜系的細(xì)胞,并且其分化過程受多種因素的調(diào)控[10]。在PDLSCs成骨分化前后,有2 171種LncRNA差異表達(dá),很大一部分LncRNA對成骨分化起著調(diào)控作用[23]。Gu等發(fā)現(xiàn)編碼為TCONS_00212979和TCONS_00212984的LncRNA作為內(nèi)源競爭RNA (competing endogenous RNA, ceRNA), 與mRNA競爭微小RNA(MicroRNA, miRNA) 34a和146a的結(jié)合位點(diǎn),通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路調(diào)節(jié)PDLSCs的成骨分化。同時也提出了LncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為以后深入地研究機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[24]。

部分LncRNA抑制了PDLSCs的成骨功能：LncRNA MEG家族與PDLSCs的成骨分化關(guān)系密切,MEG8、MEG3和MIR22HG都抑制PDLSCs的成骨分化,其中MEG3通過與BMP2的mRNA競爭hRNPI來降低BMP2水平而起作用[23,25]。Jia等研究發(fā)現(xiàn),下調(diào)LncRNA ANCR能抑制經(jīng)典Wnt通路,促進(jìn)PDLSCs的成骨分化,ANCR本身具有抑制成骨的作用[26]。其中一種機(jī)制是LncRNA ANCR直接作用于miRNA-758來降低其對Notch的抑制作用,進(jìn)而興奮經(jīng)典的Wnt通路,下調(diào)ANCR會抑制Wnt通路[27]。ANCR對于經(jīng)典Wnt通路是否存在其它作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白(RBP) Lin28A上有多個?；撬嵘险{(diào)因子-1 LncRNA(LncRNA TUG1)的結(jié)合位點(diǎn),TUG1與其相互作用的結(jié)果抑制了PDLSCs的成骨分化過程[28]。

同樣,研究者也發(fā)現(xiàn)具有積極作用的LncRNA：miR-106a-5p可以抑制PDLSCs的成骨分化,miR-106a-5p上存在LncRNA PCAT1的結(jié)合位點(diǎn),PCAT1的過表達(dá)會抑制miR-106a-5p,上調(diào)miR-106a-5p的靶基因骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP2)的表達(dá)[29-30],BMP2是一個重要的分化誘導(dǎo)因子,能激活Smad家族,促進(jìn)PDLSCs的成骨分化和骨組織的再生[31]。不僅如此,miR-106a-5p的另一個靶基因E2F5可以促進(jìn)PCAT1的表達(dá),形成了一個針對BMP2的前饋調(diào)控網(wǎng)絡(luò),該研究首次提出LncRNA-miRNA-細(xì)胞因子的前饋調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[30]。Xu等通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法調(diào)節(jié)LncRNA TWIST1在PDLSCs中的表達(dá),證實(shí)其可以促進(jìn)PDLSCs的成骨分化[32]。

LncRNA通過多種途徑和方式調(diào)節(jié)PDLSCs的成骨分化,且涉及眾多分子,需要更多的研究來明確其機(jī)制。

3.2 LncRNA調(diào)控牙周炎環(huán)境下PDLSCs的成骨分化

LncRNA的表達(dá)與疾病的發(fā)展密切相關(guān),研究LncRNA調(diào)控iPDLSCs成骨分化的機(jī)制對于應(yīng)用自體PDLSCs進(jìn)行干細(xì)胞治療具有重要意義。2014年,Zou等首次證明了慢性牙周炎組織中LncRNA與相鄰正常組織的表達(dá)存在差異[33],說明LncRNA在牙周炎的發(fā)病機(jī)制中有重要作用。LncRNA也與牙周炎的復(fù)發(fā)有關(guān),高水平的LncRNA MORT可以降低牙周炎的復(fù)發(fā)率[34]。目前的研究發(fā)現(xiàn)一些促進(jìn)iPDLSCs成骨分化的LncRNA。

炎癥作用下PDLSCs中存在大量差異表達(dá)的LncRNA和新出現(xiàn)的LncRNA,這些LncRNA與間充質(zhì)干細(xì)胞的發(fā)育和分化有關(guān),其中許多差異表達(dá)的LncRNA作為ceRNA與miRNA形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò),調(diào)節(jié)靶基因的蛋白質(zhì)編碼,影響細(xì)胞的生物學(xué)功能[35]。Mir-182可通過Foxo1負(fù)性調(diào)節(jié)成骨分化[36],Wang等[5]發(fā)現(xiàn)LncRNA-poir、mir-182和Foxo1高度相關(guān)：在牙周炎環(huán)境下,LncRNA-poir通過競爭性抑制miRNA-182的表達(dá),增強(qiáng)靶分子Foxo1的表達(dá),Foxo1又與TCF-4競爭β-catenin來抑制經(jīng)典Wnt通路,促進(jìn)iPDLSCs的成骨分化,形成LncRNA poir- mir182- Foxo1的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外,炎癥中被高度活化的NF-κB通路會影響LncRNA-poir和mir-182調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的平衡。

LncRNA ptcsc3是Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)4的上游抑制劑,通過下調(diào)TLR4間接調(diào)節(jié)牙周病原體的免疫識別,其過度表達(dá)會抑制iPDLSCs的增殖[37]。值得注意的是,ptcsc3和TLR4的表達(dá)水平僅與iPDLSCs顯著相關(guān),而與正常的PDLSCs不顯著相關(guān),因此ptcsc3和TLR4之間可能存在某些病理介質(zhì)；而且在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,ptcsc3可以抑制經(jīng)典Wnt通路的活性,其在iPDLSCs中能否對Wnt通路起到同樣的抑制作用進(jìn)而促進(jìn)iPDLSCs成骨分化,這有待今后進(jìn)一步的研究[38]。上文提到的LncRNA TWIST1對于iPDLSCs也起促進(jìn)成骨分化的作用[34]。

綜上所述,在炎癥環(huán)境中,LncRNA對iPDLSCs的成骨分化有著重要的調(diào)控作用,運(yùn)用LncRNA的調(diào)控作用改善iPDLSCs的成骨分化能力是臨床開展干細(xì)胞治療的潛在方法,但首先要將LncRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究得更加明確。

4 結(jié) 語

治療牙周炎造成的牙周組織喪失是臨床工作中的一大難題,目前利用組織工程學(xué)技術(shù)再生牙周組織是一種極具潛力的療法。作為間充質(zhì)干細(xì)胞的牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)，因其多向分化潛能和自體源性而進(jìn)入研究者的視野,逐漸成為研究熱點(diǎn)。它具有修復(fù)缺損牙周組織的能力,其中最重要的是成骨能力,但炎癥環(huán)境下的PDLSCs的成骨能力明顯下降,并且在脫離炎癥環(huán)境后也無法恢復(fù)。在臨床實(shí)踐中,醫(yī)生很難從牙周炎患者的口中取得健康的PDLSCs,恢復(fù)炎癥環(huán)境下PDLSCs的成骨分化能力并促進(jìn)牙周組織再生是解決這一問題的關(guān)鍵。LncRNA已被證明在健康和炎癥環(huán)境下對PDLSCs的成骨分化都起著重要的調(diào)控作用,其機(jī)制復(fù)雜多樣,涉及的分子及信號通路廣泛且相互影響,尚未形成明確的理論體系,LncRNA可以作為關(guān)鍵的治療靶點(diǎn)進(jìn)行研究。