重樓多糖的研究進(jìn)展

王思?jí)?，沙?ài)龍

（1.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶 404100；2.重慶三峽學(xué)院教師教育學(xué)院，重慶 404100）

重樓為百合科重樓屬多年生草本植物，又名云南重樓[Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz]，主產(chǎn)于云南省、貴州省和四川省一帶，性微寒，有小毒，味苦，歸肝經(jīng)[1]。重樓主要含有甾體皂苷、黃酮類、多糖類、植物蛻皮激素、植物甾醇、氨基酸、鞣質(zhì)和胡蘿卜素等活性成分[2-3]，有止血、抗腫瘤[4]、鎮(zhèn)痛[5]、抗氧化[6-7]及免疫調(diào)節(jié)[8]等生物活性。

研究表明，植物多糖具有多種藥理作用及生物學(xué)功能，如抗氧化[9]、抗腫瘤[10]、抗病毒[11]、免疫調(diào)節(jié)[12]、抗炎[13]和抗輻射[14]等。重樓多糖作為一種重要的植物多糖，近年來(lái)也引起了科研工作者的關(guān)注。目前，許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其提取工藝以及藥理作用已開(kāi)展了深入的研究。綜述重樓多糖的提取、含量測(cè)定、提取工藝優(yōu)化方法及免疫、抗氧化、降血脂和護(hù)肝等藥理作用，為進(jìn)一步深入研究提供參考。

1 重樓多糖的提取制備

研究表明，植物多糖具有抗腫瘤[10]、抗病毒[11]、調(diào)節(jié)免疫功能[12]、抗炎[13]和抗輻射[14]等作用，目前已有一些多糖應(yīng)用于臨床，如豬苓多糖、香菇多糖、靈芝多糖和當(dāng)歸多糖等[15-18]。大量研究證實(shí)，百合科植物多糖具有很強(qiáng)的藥理作用，如黃精多糖、貝母多糖、知母多糖、天門(mén)冬多糖和百合多糖等[19-23]。同為百合科植物的重樓，因其含有多種活性成分，且具有強(qiáng)大而廣泛的藥理作用（如重樓皂苷），其多糖也逐漸引起了科研工作者的重視，有些科研人員開(kāi)始提取制備重樓多糖并摸索其最佳提取工藝。

1.1 重樓多糖提取方法

周濃等[24]通過(guò)3種不同提取工藝（回流提取法、熱水浸提法、超聲波輔助提取法）對(duì)滇重樓多糖進(jìn)行了研究，分別探討了浸提時(shí)間、料液比、提取次數(shù)和提取溫度對(duì)滇重樓多糖得率的影響，并得到了最佳提取工藝。劉蕓等[25-26]利用Box-Behnken響應(yīng)面法結(jié)合Design-Expert 7.01版軟件，對(duì)陜西產(chǎn)重樓多糖的提取方法（熱水浸提法、超聲波輔助提取法）進(jìn)行了優(yōu)化。兩項(xiàng)研究中雖均采用超聲波輔助提取法提取重樓多糖，但二者得到的重樓多糖最佳提取工藝卻不同，分析其中原因，很有可能與二者所選用的重樓產(chǎn)地不同有關(guān)。

針對(duì)材料部位的不同，申世安等[27]采取了不同的提取方法：提取滇重樓地上莖葉多糖時(shí)采用了熱水浸提法，而在提取滇重樓地下根莖多糖時(shí)，則選擇了超聲波輔助提取法。其中滇重樓地上莖葉多糖最優(yōu)提取條件為：液料比28.64∶1 （mL/g），94.83 ℃下提取4.72 h；而滇重樓地下根莖多糖最優(yōu)提取條件為：液料比48.78∶1（mL/g），超聲波功率195.05 W，52.09 ℃下提取 19.78 min。

綜上可知，運(yùn)用回流提取法需要綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本，同時(shí)其提取率較低；熱水浸提法成本較低、操作方便，是最能進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)所用方法之一，宜于工廠化大規(guī)模生產(chǎn)；而超聲波輔助提取法提取率高，且適合于重樓多糖含量測(cè)定，可以較好地進(jìn)行重樓多糖提取前期的處理[24]。因此超聲波輔助提取法可作為實(shí)驗(yàn)室提取重樓多糖的首選。但對(duì)于不同植物多糖的提取而言，則可根據(jù)植物自身結(jié)構(gòu)、形態(tài)、性質(zhì)去選擇合適的提取工藝。

不同百合科植物采用不同提取方法所得多糖的含量不同，周濃等[24]發(fā)現(xiàn)運(yùn)用超聲波輔助提取法提取獲得的滇重樓多糖含量最多，為24.32 mg/g。此外，除重樓外，其它百合科植物提取多糖的含量和最佳方法也不同，如陶濤等[28]通過(guò)超聲波與纖維素酶協(xié)同作用提取黃精多糖，得率為39.36%；王紅博等[29]對(duì)太白貝母多糖提取工藝進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)超聲波法為其提取的最佳工藝，所測(cè)太白貝母多糖含量為0.99 mg/g。

1.2 重樓多糖含量檢測(cè)方法

目前，蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法和稱重法[30-31]為測(cè)定多糖含量的常用方法。前兩種方法原理是在強(qiáng)酸作用下將多糖水解為單糖，再與蒽酮或苯酚反應(yīng)生成衍生物，根據(jù)其衍生物的吸光值與單糖濃度呈線性關(guān)系而測(cè)得多糖含量。此兩種方法的優(yōu)點(diǎn)有：能直接測(cè)定多糖提取液、省時(shí)并極大地減少乙醇用量，從而降低提取成本；缺點(diǎn)有：無(wú)法排除單糖、寡糖及糖苷類小分子物質(zhì)對(duì)多糖含量的干擾[32]。與前兩種方法對(duì)比，稱重法過(guò)程繁瑣，但能夠排除雜質(zhì)干擾，較為準(zhǔn)確地反映出多糖的含量[27]。目前，苯酚-硫酸法因其顯而易見(jiàn)的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于植物多糖的含量測(cè)定。

蔡艷妮等[33]采用苯酚-硫酸法對(duì)重樓多糖含量進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了濃硫酸和苯酚的最佳用量分別為6.0 mL、2.0 mL，最佳顯色溫度和顯色時(shí)間分別為40 ℃、30 min。但發(fā)現(xiàn)濃硫酸和苯酚的用量較少會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)不充分，苯酚用量較多，其剩余氧化產(chǎn)物會(huì)影響檢測(cè)，因而在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，蔡艷妮等確定苯酚-硫酸法檢測(cè)重樓多糖的最佳工藝為：濃硫酸用量6.5 mL，苯酚用量2.0 mL，顯色溫度30 ℃，顯色時(shí)間30 min。對(duì)于利用蒽酮-硫酸法和稱重法測(cè)定重樓多糖含量的最佳工藝還尚未研究。因不同植物多糖的分子量、結(jié)構(gòu)等均存在差異，故不同植物多糖的含量測(cè)定方法也不同。張媛媛等[34]采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法對(duì)茶多糖含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)苯酚-硫酸法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性均優(yōu)于蒽酮-硫酸法。

1.3 確定最佳提取工藝的方法

通?？刹捎谜辉囼?yàn)或響應(yīng)面法來(lái)優(yōu)化多糖的最佳提取工藝。如周濃等[24]采用了正交試驗(yàn)法確定滇重樓多糖的最佳提取工藝，劉蕓等[25-26]、申世安等[27]則采用響應(yīng)面法進(jìn)行重樓多糖提取工藝的優(yōu)化。正交試驗(yàn)和響應(yīng)面法本質(zhì)上有區(qū)別。響應(yīng)面法是用統(tǒng)計(jì)方法尋找考慮了輸入變量值的變異或不確定性之后的最佳響應(yīng)值[35]；而正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)則同時(shí)考慮幾種因素，尋找最佳組合，注重如何科學(xué)合理安排試驗(yàn)。和響應(yīng)面法相比較，正交試驗(yàn)有一定缺陷，不能在給出的整個(gè)區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的回歸方程，也便無(wú)法找到最佳響應(yīng)值和整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合。

2 藥理作用

2.1 免疫調(diào)節(jié)作用

免疫器官主要由中樞免疫器官（骨髓、胸腺）和外周免疫器官（脾臟、淋巴組織等）組成[36]。脾臟是人體最大的外周免疫器官，可分為白髓、紅髓和邊緣區(qū)[36]。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，植物多糖可通過(guò)促進(jìn)T細(xì)胞增殖和淋巴因子激活殺傷細(xì)胞活性，通過(guò)提高B細(xì)胞活性和巨噬細(xì)胞的吞噬能力以及激活補(bǔ)體等多種途徑來(lái)激發(fā)機(jī)體的免疫功能[37]。

劉功成等[38]通過(guò)體外藥理學(xué)研究表明，重樓多糖能顯著上調(diào)小鼠脾臟組織IL-2、IL-4等白介素的表達(dá)水平，這與佟春玉等[21]對(duì)天門(mén)冬多糖的研究結(jié)果一致。此外其研究還表明重樓多糖能提高IL-2、IL-4、IL-10、GATA-3、T-bet、INF-γ 及 TNF-mRNA表達(dá)水平[38]。劉娜等[39]對(duì)同屬于百合科植物的黃精進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)黃精多糖對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力、細(xì)胞因子含量及脾淋巴細(xì)胞增殖均有影響。目前，針對(duì)重樓多糖免疫作用的研究中還未發(fā)現(xiàn)以免疫器官、免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子為指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)，國(guó)內(nèi)外科研工作者可基于此對(duì)重樓多糖免疫作用進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.2 抗氧化作用

氧在生物體內(nèi)經(jīng)過(guò)反應(yīng)，產(chǎn)生活性氧類（ROS），如羥基自由基（·OH）、過(guò)氧化氫（H2O2）和超氧根陰離子（O2-）等。1956年，Denham Harman[40]提出衰老的自由基學(xué)說(shuō)，認(rèn)為生物體的衰老過(guò)程是機(jī)體的組織細(xì)胞不斷產(chǎn)生的自由基積累的結(jié)果。在正常情況下，生物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，所以生物體能保持健康。動(dòng)物體內(nèi)存在相應(yīng)的抗氧化酶時(shí)，如SOD、GSH-Px、CAT等，可即時(shí)清除體內(nèi)多余的氧自由基，當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生的活性氧超過(guò)了體內(nèi)抗氧化酶的清除能力范圍，多余的活性氧就會(huì)損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而誘發(fā)一系列的病變。據(jù)資料顯示，植物多糖對(duì)物理、化學(xué)及生物來(lái)源的多種活性氧均具有清除作用，可提高抗氧化酶活性[41]。

劉功成等[42]將重樓多糖注入經(jīng)D-半乳糖處理后的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)小鼠的CuZn-SOD、T-SOD、GSH-Px和CAT酶活性都有顯著提高，MDA、羥基自由基、超氧陰離子含量均顯著下降。已有研究報(bào)道，硫氧還蛋白（Trx）具有抗氧化、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞凋亡等廣泛的作用，Trx主要包括硫氧還蛋白1（Trx1）和硫氧還蛋白2（Trx2），它們?cè)诩?xì)胞抗氧化方面都有重要作用[43]。劉功成等研究結(jié)果表明：經(jīng)重樓多糖處理后，小鼠脾臟中Trx1、Trx2都顯著升高，提示重樓多糖可增強(qiáng)脾臟的抗氧化作用。

申世安等[27]研究了重樓地上莖葉多糖（PPLP）和地下根莖多糖（PPRP）對(duì)體內(nèi)外抗氧化能力的影響，研究發(fā)現(xiàn)二者均降低了血清、腦、心臟和肝臟中MAD的含量，增強(qiáng)了T-SOD、CAT、T-AOC、GSHPx的活力，說(shuō)明PPLP和PPRP可通過(guò)調(diào)控抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)量來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。此外，還發(fā)現(xiàn)了PPLP和PPRP在體內(nèi)抗氧化的作用機(jī)制可能是：通過(guò)激活機(jī)體的免疫活性來(lái)增強(qiáng)一系列抗氧化酶基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化酶活力。針對(duì)于同屬百合科植物的黃精、貝母，石娟等[19]發(fā)現(xiàn)黃精粗多糖可顯著降低溴苯所致小鼠肝損傷的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量、增加小鼠肝組織的過(guò)氧化物歧化酶GSH-Px含量；劉春紅等[20]發(fā)現(xiàn)平貝母多糖能顯著降低D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠肝臟組織中丙二醛（MDA）含量、高肝組織中總抗氧化能力（T-AOC），顯著提高肝組織中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性和血清超氧化物歧化酶（SOD）活性，與重樓多糖的抗氧化作用一致。

2.3 降血脂作用

判斷高血脂癥的重要指標(biāo)通常有血液TC、TG、HDL-c和LDL-c的含量，這4個(gè)指標(biāo)也是與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的主要因素。HDL-c含量越低，TC、TG和LDL-c含量越高，越有利于高血脂癥和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[44]。AI是衡量動(dòng)脈粥樣硬化最為可靠的指標(biāo)，AI越大說(shuō)明動(dòng)脈粥樣硬化的程度越嚴(yán)重[44]。

申世安等[45]采用PPLP和PPRP進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)滇重樓多糖影響小鼠體重，在一定程度上，PPLP和PPRP可抑制因食用高脂飼料而引起的體重增長(zhǎng)，且不會(huì)導(dǎo)致小鼠體重過(guò)多下降而影響正常體重的增加；此外對(duì)血清中的相關(guān)指標(biāo)也有影響，與MG相比，PPLP-HG和PPRP-HG均能顯著增加HDL-c的含量，降低血清中TG、TC和LDL-c的含量，這與枸杞多糖、黃芪多糖[46]對(duì)高脂血癥大鼠作用的結(jié)果一致。同時(shí)兩組的AI顯著低于MG，說(shuō)明PPLP和PPRP在預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和高血脂癥方面具有良效。針對(duì)于兩者降血脂功效進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)降血脂的效果沒(méi)有顯著差別[27]。植物多糖除影響血清TC、TG、LDL-c和HDL-c含量外，還可降低肝臟TC、TG含量，如木賊多糖[47]區(qū)別于重樓多糖的作用。

2.4 保肝護(hù)肝作用

活性氧的產(chǎn)生與清除，在人體健康狀態(tài)下通常處于動(dòng)態(tài)平衡。但如果機(jī)體長(zhǎng)期攝入脂類物質(zhì)過(guò)多，因脂類物質(zhì)蓄積導(dǎo)致代謝紊亂，從而產(chǎn)生大量的活性氧。當(dāng)活性氧含量超出抗氧化酶的清除范圍時(shí)，便會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，造成機(jī)體功能的失調(diào)[48]。

申世安等[27]通過(guò)飼喂高脂詞料，給小鼠建立高脂模型，發(fā)現(xiàn)與NG相比，MG小鼠肝臟中MDA含量顯著上升，T-SOD和GSH-Px的活力顯著下降，肝臟指數(shù)顯著變大，說(shuō)明小鼠攝入過(guò)多的高脂詞料，加重了小鼠的脂質(zhì)過(guò)氧化。灌胃PPLP和PPRP的高劑量組，顯著降低了小鼠肝臟內(nèi)的MDA含量，提高了T-SOD和GSH-Px的活力，肝臟指數(shù)減小，在一定程度上抑制了肝臟內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生，說(shuō)明PPLP和PPRP具有保肝護(hù)肝作用。