楊 華, 趙 勇, 宋志剛, 李 順, 周曉輝

(1.上海市公共衛(wèi)生臨床中心, 上海 201508; 2.上海實驗動物研究中心, 上海 201203)

動物生物安全二級(animal biosafety level 2,ABSL-2)實驗室適用于操作《人間傳染的病原微生物名錄》中第三類動物病原微生物和《動物病原微生物分類名錄》中三類動物病原微生物[1-2]。在生命科學(xué)研究中，該類病原微生物是廣大科研工作者關(guān)注焦點。ABSL-2 實驗室也成為目前開展感染性科研項目使用率最高的實驗室。對ABSL-2 實驗室必須進(jìn)行嚴(yán)格有效的管理，以提高實驗室生物安全保障支撐水平。

上海市公共衛(wèi)生臨床中心(以下簡稱“本中心”)的ABSL-2 實驗室，長期為腸道病毒71 型、寨卡病毒、皰疹病毒及金葡菌、沙門氏菌等細(xì)菌引起的新發(fā)及再現(xiàn)傳染病的致病性研究，以及疫苗研究及抗體制備等動物實驗提供科研平臺，至今運行已十余年，建立了一個有效的生物安全管理模式。筆者根據(jù)多年來從事ABSL-2 管理工作實際經(jīng)驗，分析、歸納、總結(jié)了對ABSL-2 實驗室開展項目管理方面的關(guān)鍵要素，以期供ABSL-2 管理初學(xué)者或相關(guān)同行參考。

1 ABSL-2 實驗室設(shè)計和設(shè)施建設(shè)

ABSL-2實驗室設(shè)施的設(shè)計和建設(shè)是保障生物安全的第一道防線[3]，必須遵循和依據(jù)國家的系列標(biāo)準(zhǔn)[3-6]。ABSL-2 實驗室的建筑技術(shù)要考慮布局科學(xué)合理，保證氣流正常流向。按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB19489-2008 要求，動物飼養(yǎng)間出入口設(shè)置緩沖間。本中心ABSL-2 實驗室，考慮人流、物流、動物流合理流向，嚴(yán)格按照防護(hù)區(qū)和輔助區(qū)的要求劃分，在兩區(qū)間設(shè)緩沖間。為了進(jìn)一步降低ABSL-2實驗室人員感染及周邊環(huán)境受到污染的風(fēng)險，同時要保持室內(nèi)空氣清潔，動物飼養(yǎng)間室內(nèi)氣壓控制為負(fù)壓潔凈狀態(tài)，并保持穩(wěn)定的壓力梯度以防止污染物擴(kuò)散[7]。

ABSL-2實驗室入口處應(yīng)張貼醒目的生物危害標(biāo)志，以提醒使用者了解危害程度及個人防護(hù)級別。ABSL-2 實驗室小動物飼養(yǎng)籠具目前選用動物獨立送回風(fēng)凈化籠具(IVC)，采用三級過濾，并且籠盒內(nèi)設(shè)閉氣裝置的進(jìn)排氣閥，可有效防止環(huán)境、動物與人員間交叉感染，保障實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性[8]。另外，ABSL-2 實驗室應(yīng)配備有操作防護(hù)和消毒滅菌的設(shè)施設(shè)備，例如生物安全柜、高壓滅菌器以及過氧化氫發(fā)生器等。

本中心ABSL-2 實驗室的外界新風(fēng)經(jīng)過三級過濾后進(jìn)入房間，飼養(yǎng)間內(nèi)的廢氣經(jīng)初效、中效過濾器處理后經(jīng)高效過濾器過濾，再經(jīng)廢氣處理裝置處理后排出。實驗結(jié)束，施行安死術(shù)后的動物尸體，經(jīng)121 ℃ 30 min 高壓滅菌處理后，集中送有醫(yī)療廢棄物處理資質(zhì)的單位焚燒爐統(tǒng)一進(jìn)行無害化處理。

2 ABSL-2 實驗室審批管理

2.1 資質(zhì)備案及年度審查

目前，國家對ABSL-2 實驗室的資質(zhì)審批，普遍采取屬地管理，通常是實驗室所在地的衛(wèi)生健康委員會或農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳主管機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)備案管理與審批。同時，在ABSL-2 實驗室啟用前，應(yīng)取得政府管理部門頒發(fā)的“實驗動物使用許可證”， 按照實驗動物特殊實驗設(shè)施管理要求,動物生物安全實驗室應(yīng)同時符合GB19489-2008 和GB50346-2011 的規(guī)定。資質(zhì)備案時將申報資料，包含管理文件體系、設(shè)備、病原微生物種類、實驗室平面圖、實驗活動項目及生物安全責(zé)任承諾書等材料上報地方衛(wèi)生監(jiān)督所，由所在地的衛(wèi)生健康委員會或農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳主管機(jī)構(gòu)審查備案。取得備案的ABSL-2實驗室可開展備案相關(guān)病原體的科研活動，除了做好日常自檢之外，還需接受衛(wèi)生監(jiān)督所年度定期現(xiàn)場審查及不定期抽查監(jiān)督。衛(wèi)生監(jiān)督所工作人員根據(jù)實驗活動涉及病原微生物種類，實驗中管理實施各環(huán)節(jié)進(jìn)行病原微生物實驗活動的評估，以提高實驗室生物安全意識，最大限度減少生物危害。

2.2 項目開展申請及審批

在實驗開始之前，實驗項目需要通過動物實驗福利、倫理審查?？蒲腥藛T遞交申請材料，由所在機(jī)構(gòu)的動物使用和管理委員會(IACUC)依據(jù)動物保護(hù)、動物福利、動物倫理和綜合性科學(xué)評估的原則，進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)督和評估，以盡量減少實驗動物數(shù)量，優(yōu)化技術(shù)線路和方法，促進(jìn)實驗動物的合理使用。

此外，科研人員必須提前向所在機(jī)構(gòu)生物安全委員會遞交“ABSL-2 實驗室實驗活動申請表”。委員會委員將參照《人間傳染的病原微生物名錄》或《動物病原微生物分類名錄》[1-2]要求，針對申請涉及病原微生物危害等級、實驗方法、危害評估、廢棄物處理、實驗操作及剩余菌毒種處理方式等方面信息嚴(yán)格審核。通過對實驗計劃進(jìn)行風(fēng)險評估后，機(jī)構(gòu)生物安全委員會批準(zhǔn)，申請的實驗內(nèi)容才可以實施開展。

3 ABSL-2 實驗室設(shè)施運行管理

ABSL-2 動物飼養(yǎng)間的溫度、濕度、照度、空氣潔凈度等環(huán)境參數(shù), 均應(yīng)按《實驗動物環(huán)境與設(shè)施》(GB14925-2010)要求管理, 并符合《生物安全實驗室建筑技術(shù)規(guī)范》(GB50346-2011)和《實驗室生物安全通用要求》(GB19489-2008)[3-5]。

溫度、濕度實現(xiàn)自動控制：動物飼養(yǎng)間內(nèi)溫度、濕度變化通過傳感器顯示在溫度、濕度控制器面板上，并傳輸至中控室電腦系統(tǒng)。為了加強(qiáng)防護(hù)區(qū)管理，另建立一套功能完備的電視監(jiān)控系統(tǒng)及溫度異常報警系統(tǒng)，方便系統(tǒng)外工作人員實時監(jiān)測實驗室內(nèi)溫度、濕度變化。

動物飼養(yǎng)間照明燈具的定時控制: 可調(diào)光照明系統(tǒng)用于調(diào)節(jié)燈光亮度, 并設(shè)定調(diào)光系統(tǒng)定時開啟、關(guān)閉時間, 保證了實驗動物對光亮度的需求。

組合式送排風(fēng)系統(tǒng): 送排風(fēng)機(jī)組采用一用一備、自動切換的工作模式運行, 保證設(shè)施正常運作。本中心的ABSL-2 實驗室送風(fēng)采用經(jīng)三級空氣過濾凈化后進(jìn)入的全新風(fēng), 送風(fēng)和排風(fēng)機(jī)制通過啟停和故障連鎖控制, 實驗室啟停時，排風(fēng)應(yīng)先于送風(fēng)開啟, 而后于送風(fēng)關(guān)閉, 從而杜絕整個運行期間實驗室出現(xiàn)正壓現(xiàn)象。動物飼養(yǎng)間通過調(diào)節(jié)排風(fēng)以維持室內(nèi)壓力和壓差穩(wěn)定, 設(shè)計風(fēng)量時考慮了IVC 籠具、生物安全柜等設(shè)施設(shè)備的通風(fēng)量。

嚴(yán)格的壓力梯度控制：為了防止交叉感染，本中心的ABSL-2實驗室內(nèi)氣流由輔助區(qū)流向防護(hù)區(qū)，最終流入核心操作間。實驗室防護(hù)區(qū)房間內(nèi)送風(fēng)和排風(fēng)采取上送下排的方式進(jìn)行，防護(hù)區(qū)空氣采用全新風(fēng)進(jìn)風(fēng)，送風(fēng)經(jīng)過HEPA 過濾器過濾。實驗室實行分區(qū)管理，各區(qū)相鄰房間之間設(shè)定了壓力梯度。按照更衣室→風(fēng)淋(-5 Pa)→前緩沖室(-10 Pa)→內(nèi)走廊(-15 Pa)→后緩沖室(-20 Pa)→動物飼養(yǎng)室及實驗室(-30 Pa)的壓力梯度和空氣流向，密閉門開向壓力較高的房間或走廊。動物飼養(yǎng)室及實驗室為ABSL-2實驗室的核心工作間，壓力最低,由內(nèi)向外壓力依次遞增。保證氣流定向移動，既防止交叉感染，又保護(hù)設(shè)施、實驗動物及工作人員的安全。

4 ABSL-2 實驗室人員管理

人員指實驗動物及動物實驗從業(yè)者，包括工程技術(shù)人員、研究人員、管理人員、獸醫(yī)師、后勤人員、階段性從業(yè)人員[9-12]。

4.1 人員資質(zhì)管理

所有進(jìn)入實驗室的工作人員，均必須接受培訓(xùn)并通過考核持證上崗，包括“動物實驗上崗”和 “生物安全”雙重培訓(xùn)上崗證。新工作人員通過培訓(xùn)考核后，還需在有資格的工作人員指導(dǎo)下工作一個月以上，才能獲得上崗證。專業(yè)能力方面，要求進(jìn)入實驗室人員必須具備相關(guān)專業(yè)背景，熟練掌握動物實驗操作技能，并熟悉實驗室生物安全常識。

4.2 人員培訓(xùn)與考核

人員培訓(xùn)按照崗位分類進(jìn)行，以崗位職責(zé)為基礎(chǔ)，制定科學(xué)規(guī)范的人員培訓(xùn)內(nèi)容和考核體系，不同崗位分組進(jìn)行。

首先，通過市級的實驗動物從業(yè)者上崗培訓(xùn)，或參加單位的上崗培訓(xùn)并通過考核，取得上崗證。其次，實驗人員需通過單位生物安全委員會組織的生物安全理論與實踐培訓(xùn)，并考核合格后取得證書。

在生物安全培訓(xùn)方面，要制定分段式培訓(xùn)計劃，從生物安全基本原理學(xué)習(xí)入手，到實驗室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范的指導(dǎo)性實踐訓(xùn)練，再到帶教老師親自示范，一對一現(xiàn)場指導(dǎo)。培訓(xùn)采用專題講座、知識競賽、示范練習(xí)、模擬演練等理論和實踐結(jié)合的方式。受訓(xùn)者初次進(jìn)入ABSL-2 實驗室，都需要由帶教老師或區(qū)域負(fù)責(zé)人帶入，并詳細(xì)講解每個區(qū)域主要工作的注意事項等。

培訓(xùn)結(jié)束后進(jìn)行培訓(xùn)評估，評估培訓(xùn)對象對培訓(xùn)內(nèi)容的記憶或操作執(zhí)行情況，評估培訓(xùn)對象工作中的行為變化，并建檔保存。

4.3 人員準(zhǔn)入控制

實驗室人員進(jìn)入管理采取嚴(yán)格的門禁授權(quán)方式，僅授權(quán)人員可刷卡進(jìn)入。課題組實驗人員準(zhǔn)入按批準(zhǔn)程序執(zhí)行，課題組項目應(yīng)提前完成實驗活動危害性評估的申請審核，實驗人員接受ABSL-2 實驗室內(nèi)部培訓(xùn)，且經(jīng)考核合格后，才能被授權(quán)打開門禁。

實驗人員進(jìn)實驗室前需填寫“ABSL-2 實驗預(yù)約登記表”，并計劃好每周實驗時間。每次進(jìn)出實驗室時須認(rèn)真完成登記(人員、進(jìn)出時間及帶入物品等基本信息), 嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)規(guī)定的路線進(jìn)行個人防護(hù)裝備的穿戴及更換。

4.4 人員健康監(jiān)督

對從業(yè)人員進(jìn)行長期健康監(jiān)測，每年組織體檢并建立健康檔案，在開展實驗工作前還要采集本底血清留檔，必要時應(yīng)當(dāng)對其進(jìn)行預(yù)防接種。由專人負(fù)責(zé)人員健康監(jiān)測工作，及時了解人員的健康狀況，確保人員的職業(yè)健康和福利。

實驗室工作人員若出現(xiàn)下列任一情況，不宜進(jìn)入ABSL2 實驗室: 患發(fā)熱性疾病、上呼吸道感染、抵抗力下降、已經(jīng)在核心區(qū)內(nèi)連續(xù)工作4 h以上、其他原因造成疲勞狀態(tài)等。工作人員一旦出現(xiàn)與實驗相關(guān)的病原微生物感染類似的臨床癥狀，應(yīng)立即匯報實驗室負(fù)責(zé)人，并向生物安全委員會及單位負(fù)責(zé)人報告，啟動相關(guān)應(yīng)急處理方案，同時派專人陪同其及時就診。

5 ABSL-2 實驗室實驗操作管理

5.1 個人防護(hù)

個體防護(hù)裝備(PPE)使用是控制生物安全風(fēng)險的終端措施，選擇和使用合適的P P E 是避免ABSL-2 實驗室感染的關(guān)鍵。實驗人員在ABSL-2實驗室中，應(yīng)根據(jù)實驗特點，按照不同傳播途徑疾病的預(yù)防和隔離要點，針對重點防護(hù)部位謹(jǐn)慎選擇合適的PPE，并掌握正確使用方法，避免接觸污染，加強(qiáng)個人防護(hù)。ABSL-2 實驗室中氣溶膠傳播是實驗人員發(fā)生獲得性感染的主要途徑之一，因此特別要加強(qiáng)呼吸裝備防護(hù)。

5.2 規(guī)范操作

實驗操作前，生物安全柜的臺面須預(yù)先鋪上鋪巾，以防止臺面污染。實驗中所有涉及動物操作的過程，如換料、添水、換籠、感染、注射、解剖取材等，都必須在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，并熟悉動物實驗相關(guān)操作技能和規(guī)程。實驗操作中，為了降低生物安全風(fēng)險，應(yīng)注意以下幾方面：1)樣品處理和移液過程中動作輕柔，槍頭在液面下輕輕吹打混勻，避免濺灑和產(chǎn)生氣溶膠；2)樣品正確蓋好后應(yīng)無遺漏，在容器外部不能有殘留物，有溢灑的污染物，要及時使用適當(dāng)消毒滅菌劑對工作表面和被污染物進(jìn)行處理；3)若手部接觸到感染性物質(zhì)，消毒后脫去外層手套，及時更換新手套；4)當(dāng)必須使用尖銳物時，如移液槍頭、注射器等，應(yīng)小心操作避免傷害，收置于利器盒內(nèi)保管。所有的污染物品及污水經(jīng)無害化處理后方可移出實驗室[13-14]。

5.3 清場消毒

實驗結(jié)束后認(rèn)真做好清場工作，所有實驗物品移出生物安全柜前都應(yīng)打包入高壓滅菌袋，并用適當(dāng)?shù)南緞缇砻嫦?。換下的IVC籠具在生物安全柜內(nèi)放入高壓滅菌袋內(nèi)，經(jīng)表面消毒后入高壓鍋滅菌，然后徹底清洗。未使用完的感染性生物材料、防護(hù)區(qū)的污染材料等要經(jīng)過高壓滅菌銷毀，如實填寫操作和處理記錄。最后，生物安全柜完成內(nèi)壁的消毒擦拭后繼續(xù)運行10 min，再進(jìn)行紫外燈消毒15 min，方可關(guān)閉。

實驗室出風(fēng)口的高效過濾器每半年更換一次，高效過濾器由有資質(zhì)的專業(yè)人員在實驗室工作人員陪同下，進(jìn)行卸載和更換，更換高效過濾器前必須徹底消毒，通常采用過氧化氫干霧熏蒸的方法，對回風(fēng)口沒有腐蝕性；消毒后的舊高效過濾器放入生物安全袋后，由專職人員送到有資質(zhì)的焚燒點處理。

一個實驗周期后，ABSL-2 實驗室可用過氧化氫對空間進(jìn)行熏蒸滅菌消毒。過氧化氫消毒是使用過氧化氫熏蒸器完成的干霧熏蒸消毒操作，最后將過氧化氫蒸汽催化為水蒸氣和氧氣這些無害的分解產(chǎn)物，使滅菌空間達(dá)到無菌。這種熏蒸消毒方法目前是最安全的一種干霧熏蒸，滅菌有效、環(huán)保，無有害物質(zhì)殘留，且能完全殺滅嗜熱脂肪芽孢桿菌[15-16]。熏蒸 48 h 后開啟實驗室送排風(fēng)系統(tǒng)，空置1～2 周，做空氣沉降菌檢測，打開培養(yǎng)皿蓋平板收集30 min 后，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h 后觀察菌落生長情況，沉降菌小于2 菌落(cfu)/皿為檢測合格，后續(xù)重新投入使用[17]。

6 ABSL-2 實驗室應(yīng)急事件處置及防范

預(yù)案制定、組織應(yīng)急演練、緊急事件處置，是應(yīng)急事件處置缺一不可的三個核心環(huán)節(jié)。

應(yīng)按照實驗活動種類、設(shè)施設(shè)備狀況、人員能力現(xiàn)狀和管理體系文件的執(zhí)行情況，制定生物安全事故應(yīng)急防控預(yù)案[18]。預(yù)案要適合實驗室的特點，具有可操作性。每年定期安排相關(guān)人員參加應(yīng)急演練培訓(xùn)，熟悉意外發(fā)生后的正確有效處置方法。一旦發(fā)生緊急事件，立即啟動應(yīng)急處置程序：首先處理好菌毒種及感染性樣品，并做好現(xiàn)場消毒、滅菌處理，嚴(yán)防病原微生物擴(kuò)散，同時做好消防處置、人員救治及撤離等，并按照程序及時進(jìn)行事故上報和處置。事后應(yīng)分析原因，列入糾正措施，總結(jié)經(jīng)驗，進(jìn)一步加強(qiáng)預(yù)防。所有人員必須嚴(yán)格按照應(yīng)急預(yù)案以及相關(guān)操作規(guī)程進(jìn)行處理, 以保護(hù)人身安全為第一原則。

7 ABSL-2 實驗室生物安全的發(fā)展展望

7.1 需進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)生物安全風(fēng)險評估

生物安全風(fēng)險評估是ABSL-2 實驗室管理核心內(nèi)容。病原微生物、儀器設(shè)備及實驗室活動、廢棄物的生安風(fēng)險評估、動物實驗操作處理、個人防護(hù)方式的不同，會導(dǎo)致生物安全危害的差異很大。因此，實驗室要根據(jù)風(fēng)險評估的結(jié)果，采用不同的生物安全管理要求和措施。針對各環(huán)節(jié)的風(fēng)險差異，細(xì)化安全防范制度和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，進(jìn)一步采取相應(yīng)的防范措施，提高生物安全防護(hù)水平。

7.2 需進(jìn)一步完善生物安全管理體系

應(yīng)不斷完善科學(xué)、有效的生物安全管理體系，加強(qiáng)生物安全管理體系運行。定期維護(hù)設(shè)施設(shè)備、檢查更新個人防護(hù)裝備；強(qiáng)化人員培訓(xùn)考核與健康監(jiān)護(hù)；強(qiáng)化生物安全意識；加強(qiáng)安全檢查，及時消除隱患；進(jìn)一步強(qiáng)化風(fēng)險控制措施，保護(hù)環(huán)境不受污染。同時需建立學(xué)習(xí)機(jī)制，強(qiáng)化動物實驗生物安全相關(guān)前沿科技的交流學(xué)習(xí)，進(jìn)一步提高ABSL-2 實驗室的保障水平；提供ABSL2共享平臺，確保相關(guān)科研活動的規(guī)范開展，為相關(guān)科研攻關(guān)任務(wù)保駕護(hù)航。