納米材料對環(huán)境抗生素抗性基因污染擴散影響的研究進展

韓雪，馬曉琳，晁韶良，劉朝瑩

江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013

抗生素濫用是發(fā)展中國家面臨的一個威脅公共衛(wèi)生安全的重要問題?？股氐拈L期使用，已經(jīng)迫使微生物不斷進化出抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)以抵御抗生素的脅迫。在這一矛與盾不斷升級的過程中，抗生素和細(xì)菌耐藥性之間總體呈現(xiàn)一種平衡狀態(tài)。但是近年來，抗生素濫用及其引發(fā)的ARGs環(huán)境擴散，已經(jīng)導(dǎo)致越來越嚴(yán)重的健康風(fēng)險及生態(tài)破壞。因此，細(xì)菌耐藥性進化與變異以及ARGs在環(huán)境研究領(lǐng)域的傳播已日益受到高度關(guān)注。在眾多促進ARGs環(huán)境擴散的因素中，納米材料是近年來新出現(xiàn)并逐漸受到關(guān)注的一類新型環(huán)境效應(yīng)物質(zhì)。納米材料作為一種新型環(huán)境污染物，正在不可避免地以多種方式被釋放到環(huán)境中，因此，其對ARGs環(huán)境擴散的影響，已經(jīng)開始受到研究者的關(guān)注。本文擬對近年來國內(nèi)外在納米材料促進ARGs環(huán)境擴散領(lǐng)域的相關(guān)研究進行概述，旨在為ARGs環(huán)境污染評估以及納米材料非毒性環(huán)境效應(yīng)評價等相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 ARGs擴散的危害和影響因素(Harms and influencing factors of ARGs diffusion)

1.1 ARGs擴散的社會危害及產(chǎn)生機制

自然循環(huán)系統(tǒng)特別是水循環(huán)能使聚到一起的不同種類、不同來源的ARGs在不同細(xì)菌之間進行轉(zhuǎn)移傳播，從而增加環(huán)境細(xì)菌從低耐藥性向高耐藥性，從單一耐藥向多重耐藥甚至泛耐藥轉(zhuǎn)化，并最終形成超級細(xì)菌的潛在風(fēng)險[1]，而超級細(xì)菌的出現(xiàn)會導(dǎo)致目前使用的抗生素失效，使得人類將面臨無藥可用的境地。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，耐藥細(xì)菌甚至超級細(xì)菌所引起的全球死亡率每年已接近70萬，預(yù)計到2050年將增加到每年1 000萬[2-3]。ARGs擴散已然成為一個嚴(yán)重威脅全球公共衛(wèi)生安全的重要問題[4]。另外，ARGs的擴散還能導(dǎo)致養(yǎng)殖業(yè)、水產(chǎn)業(yè)和種植業(yè)中病原微生物耐藥性的增強，從而迫使抗生素的使用量不斷增大。而這不但增加了生產(chǎn)成本，而且會進一步加劇ARGs的擴散。

細(xì)菌耐藥性的提高主要有3種方式，一是來自于抗生素濫用所產(chǎn)生的抗生素選擇壓力引起細(xì)菌自身的抗生素抗性突變；二是親代與子代之間基因垂直轉(zhuǎn)移；三是細(xì)菌通過水平基因轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer, HGT)的方式獲得外源性ARGs，而這正是目前細(xì)菌獲得耐藥性的主要方式[5]。通常，細(xì)菌間發(fā)生HGT主要通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合(圖1)等3種方式進行[6]。轉(zhuǎn)化是指處于感受態(tài)的細(xì)菌從環(huán)境中直接攝取游離狀態(tài)的DNA，使其在細(xì)胞內(nèi)進行整合表達。轉(zhuǎn)導(dǎo)是基因借助病毒進行轉(zhuǎn)移，即噬菌體攻擊細(xì)菌細(xì)胞后，其攜帶的DNA等遺傳物質(zhì)進入細(xì)菌內(nèi)部的過程。接合是借助質(zhì)粒，通過細(xì)菌細(xì)胞間的接觸發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移。

1.2 水環(huán)境中ARGs污染現(xiàn)狀

2004年Rysz和Alvarez[7]首次提出ARGs已成為一個環(huán)境污染問題，而2006年P(guān)ruden等[8]明確提出將ARGs作為一種新型環(huán)境污染物。自此ARGs所導(dǎo)致的環(huán)境污染問題逐漸成為環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點。

作為一種環(huán)境污染物，ARGs能在環(huán)境細(xì)菌之間水平傳播[9]，并廣泛出現(xiàn)于沉積物、湖泊、河流、土壤和污水處理廠廢水等多種環(huán)境基質(zhì)中。目前，已在不同的水環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了多種抗生素抗性細(xì)菌，特別是在醫(yī)療實踐中常見的大腸桿菌(Escherichiacoli)、克雷白氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)和假單胞菌(Pseudomonades)等致病菌[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在1940—2008年期間，荷蘭采集的沉積物樣品中包括大環(huán)內(nèi)酯、青霉素和四環(huán)素在內(nèi)的ARGs都呈逐年上升趨勢[11]。而在我國長江三角洲地區(qū)的ARGs調(diào)查中，檢測到了8種四環(huán)素ARGs(tetA、tetB、tetC、tetG、tetO、tetM、tetW和tetX)和2種磺胺類ARGs(sulΙ和sulⅡ)[12]。在北江水域也檢測到四環(huán)素、紅霉素和磺胺二甲嘧啶耐藥細(xì)菌和基因，且含量顯著高于美國科羅拉多州北部河流的研究結(jié)果[13]。在城市居民區(qū)、醫(yī)院和城市污水中也檢測到抗環(huán)丙沙星、磺胺甲惡唑、甲氧芐啶、喹諾酮、萬古霉素和四環(huán)素的ARGs和細(xì)菌[14-17]。

圖1 抗生素抗性基因(ARGs)水平轉(zhuǎn)移方式分子機制示意圖Fig. 1 Diagram of the molecular mechanism of horizontal transfer of antibiotic resistance genes (ARGs)

1.3 影響ARGs傳播的因素

ARGs的HGT是在開放的自然環(huán)境中進行的，在此過程中，很多環(huán)境理化因素都能影響ARGs的HGT。例如，環(huán)境pH值和溫度會影響ARGs的傳播。Huang等[18]發(fā)現(xiàn)，酸性條件有利于四環(huán)素抗性基因的HGT，而堿性條件則會抑制轉(zhuǎn)移過程的進行。這可能是由于酸性條件能增加攜帶ARGs的質(zhì)粒數(shù)量，增強抗性菌株繁殖，從而促進ARGs的水平傳播。Nagachinta和Chen[19]研究了不同溫度條件下ARGs的接合轉(zhuǎn)移過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接合轉(zhuǎn)移發(fā)生在17～37 ℃之間，而低于該溫度則檢測不到接合轉(zhuǎn)移子。這可能是由于F菌毛的表達受到環(huán)境溫度調(diào)控，在25 ℃以下F菌毛基因不表達[20]?？股禺a(chǎn)生的選擇壓力是ARGs產(chǎn)生HGT的首要因素，即使低劑量的抗生素也能加快ARGs的HGT和擴散[21-22]。而氯氣、雙氧水及紫外線等消毒措施也能對ARGs轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。Ye等[23]發(fā)現(xiàn)，亞抑制濃度的游離氯、氯胺及雙氧水可以促進含多種ARGs的質(zhì)粒在屬內(nèi)和跨屬細(xì)菌間的HGT。Lu等[24]證實環(huán)境相關(guān)濃度的三氯生能促進含多種ARGs的質(zhì)粒在屬內(nèi)和跨屬產(chǎn)生HGT。但是Chang等[25]發(fā)現(xiàn)UV254處理卻能有效降解細(xì)菌胞外的ARGs。

另有許多研究證實，環(huán)境中的離子液體、重金屬和有機化合物等環(huán)境污染物也能對ARGs的HGT具有不同程度的促進作用。Wang等[26]發(fā)現(xiàn)離子液體能顯著促進質(zhì)粒介導(dǎo)的ARGs的接合轉(zhuǎn)移。Zhang等[27]研究了低濃度重金屬對ARGs在細(xì)菌間的HGT的影響，證實亞抑制濃度的重金屬可以提高ARGs的轉(zhuǎn)移效率。而Jiao等[28]研究紡織印染廢水中的6種代表性有機化合物對抗性質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響，發(fā)現(xiàn)6種有機化合物均可提高ARGs接合轉(zhuǎn)移效率。而納米材料的廣泛使用已導(dǎo)致其釋放到環(huán)境中，成為一種新型環(huán)境污染物，并在環(huán)境中與ARGs不可避免地相遇，從而對ARGs的傳播產(chǎn)生重要影響。

2 納米材料對ARGs擴散的影響(Effects of nanomaterials on ARGs diffusion)

2.1 納米材料應(yīng)用及微生物環(huán)境效應(yīng)

納米材料因具有小尺寸效應(yīng)、界面與表面效應(yīng)、獨特的化學(xué)性能，使其在電子、化工、醫(yī)療和環(huán)境保護等眾多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[29]。但是納米材料的大量生產(chǎn)和使用，使其不可避免地被釋放到環(huán)境中。納米材料易擴散、難回收，進入環(huán)境后會對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不利影響。

納米材料常具有多種不同的途徑對微生物產(chǎn)生毒性效應(yīng)。例如通過吸附或者靜電作用結(jié)合于微生物細(xì)胞膜表面，進而對細(xì)胞產(chǎn)生損傷[30]。納米材料還能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性和DNA損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[31]。另外光響應(yīng)納米材料還可以通過光激發(fā)產(chǎn)生活性氧，并進而誘發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激作用并產(chǎn)生毒性脅迫效應(yīng)[32]。納米材料對微生物細(xì)胞膜穩(wěn)定性及氧化應(yīng)激機制的沖擊，能夠影響ARGs的跨膜進入過程以及細(xì)菌相關(guān)基因的表達，進而影響ARGs的轉(zhuǎn)移效率。

納米材料除了會對微生物造成毒性損傷，還能產(chǎn)生其他的非毒性效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，低光強紫外線光催化處理下，納米TiO2產(chǎn)生的低水平光生活性氧(ROS)雖不能導(dǎo)致細(xì)胞毒性，卻能阻礙生物膜的正常發(fā)育[33]。而生物膜的形成能夠縮短環(huán)境微生物細(xì)胞之間的空間距離，從而對ARGs的水平傳播具有潛在影響。

2.2 納米材料對ARGs環(huán)境擴散的影響

近些年來，隨著納米材料環(huán)境影響研究的不斷深入，納米材料的非毒性環(huán)境效應(yīng)也逐漸進入人們的視野。其中，納米材料對于ARGs在環(huán)境中水平擴散的影響尤為受到重視(表1)。

大部分納米材料在純菌體系中對ARGs擴散能起到促進作用。如Qiu等[34]研究了納米Al2O3濃度、接合菌液密度、接合時間以及接合溫度等因素對ARGs接合轉(zhuǎn)移的影響，發(fā)現(xiàn)在最適宜的條件下納米Al2O3能將RP4質(zhì)?？鐚俚霓D(zhuǎn)移效率提高200倍以上，并將屬內(nèi)的轉(zhuǎn)移效率提高至250倍以上。Ding等[35]也發(fā)現(xiàn)納米Al2O3可以顯著促進革蘭氏陰性菌E.coli攜帶的耐藥性質(zhì)?？鐚俎D(zhuǎn)移至革蘭氏陽性菌Staphylococcusaureus。Qiu等[36]還發(fā)現(xiàn)納米TiO2也能顯著提高RP4質(zhì)粒在大腸桿菌間的接合轉(zhuǎn)移，在輕微抑制細(xì)菌生長的情況下，納米TiO2可以將接合轉(zhuǎn)移效率提高56倍。Guo和Zhang[37]的研究表明，氧化石墨烯(GO)對抗生素抗性細(xì)菌活性影響較??；高濃度GO (>10 mg·L-1)可損傷耐藥性質(zhì)粒，降低細(xì)菌對抗生素的耐藥性，而低濃度GO (<1 mg·L-1)幾乎不損傷質(zhì)粒，且所有實驗濃度的GO都能顯著提高ARGs水平的轉(zhuǎn)移效率。這些結(jié)果顯示，對于不溶性的納米材料，因其機械損傷對細(xì)菌所造成的脅迫較小。在此情況下，納米材料優(yōu)越的吸附性能促進ARGs和菌體的結(jié)合，從而能顯著促進ARGs的轉(zhuǎn)移效率。而對于能夠釋放有毒重金屬離子的具有較高微生物毒性的納米材料，其對ARGs轉(zhuǎn)移的促進作用只能在低脅迫條件下體現(xiàn)出來。Wang等[38]發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌暴露于亞致死濃度(1～10 mg·L-1)的ZnO納米顆?？娠@著提高抗生素抗性質(zhì)粒RP4的接合頻率，其中大腸桿菌間的接合轉(zhuǎn)移效率可提高24.3倍，混合菌群的水平轉(zhuǎn)移效率可提高8.3倍。此外，納米ZnO還將大腸桿菌攝取裸質(zhì)粒pGEX4T-1的轉(zhuǎn)化效率提高3倍。在此過程中，除了納米ZnO的吸附作用外，其毒理效應(yīng)對細(xì)胞膜穩(wěn)定性的降低，也可能是促進質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的重要原因。

表1 納米材料對ARGs轉(zhuǎn)移的影響Table 1 Effects of nanomaterials on ARGs transfer

注：TSS表示總懸浮固體，GO表示氧化石墨烯，nZVI表示納米零價鐵。

Note: TSS stands fortotal suspended solid; GO stands for graphene oxide; nZVI stands for nanoscale zero-valent iron.

實際水體和廢水處理中環(huán)境條件復(fù)雜且微生物也多為混合菌群。納米材料對ARGs在實際環(huán)境傳播的影響較為復(fù)雜。Ren等[39]研究了生物污水處理廠中抗生素抗性細(xì)菌和ARGs的去除，他們利用納米TiO2修飾的聚偏氟乙烯超濾膜處理污水處理廠的二級出水，發(fā)現(xiàn)該膜上的納米TiO2在紫外光激發(fā)下可以有效地去除98%的ARGs，從而有效控制ARGs的HGT。Karaolia等[40]利用TiO2修飾的還原性GO (TiO2-rGO)材料對城市污水中的抗性細(xì)菌及基因進行去除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在太陽光照條件下實際污水中ampC、mecA和ecfX基因可被成功去除，但sulI和ermB基因在處理后仍然能檢測到。這些研究應(yīng)該都是基于納米材料光激發(fā)所產(chǎn)生的活性氧可氧化降解DNA，進而實現(xiàn)了對實際環(huán)境中ARGs擴散的控制。另外，非光催化納米材料也能通過其吸附能力抑制ARGs的傳播。Zou等[41]研究GO和抗生素共存的條件下對湖水中細(xì)菌攝取抗生素和ARGs轉(zhuǎn)移的影響，發(fā)現(xiàn)GO可以和胞外抗生素形成復(fù)合物從而抑制細(xì)菌攝取抗生素，并將ARGs豐度減少2～3個數(shù)量級，同時GO在最適條件下可將攜帶ARGs的整合子轉(zhuǎn)移效率減低55倍。Yu等[42]研究GO納米片去除實際水樣中的ARGs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GO可以高效地去除環(huán)狀和雙鏈DNA所攜帶的tetA、sulII、ermB以及ampC等抗性基因。但是陸賢等[43]研究了納米零價鐵(nZVI)對污水中耐四環(huán)素菌耐藥特性的影響，發(fā)現(xiàn)nZVI能顯著促進四環(huán)素耐藥基因的轉(zhuǎn)移，并且轉(zhuǎn)移頻率在nZVI濃度為50 mg·L-1時達到最大。而Huang等[44]研究了CuO和ZnO納米顆粒對污泥厭氧消化過程中ARGs增殖的影響，發(fā)現(xiàn)CuO和ZnO可促進tetC、tetQ、sulI和sulII的環(huán)境傳播。這些結(jié)果顯示納米材料對ARGs擴散的作用可能涉及多種因素和機制，其最終的影響可能取決于多因素協(xié)同作用的綜合效果。

3 納米材料對ARGs擴散的影響機制(Mechanisms of nanomaterials on ARGs diffusion)

目前，關(guān)于納米材料對ARGs擴散影響機制的研究主要集中于納米材料本身物理性質(zhì)對細(xì)菌物理狀態(tài)的影響以及納米材料產(chǎn)生的ROS對細(xì)菌生理代謝的調(diào)控這2個方面(圖2)。

3.1 物理作用

納米材料因具有超大的比表面積而易于附著于細(xì)胞表面[30]，甚至能最終被細(xì)菌內(nèi)化[45]。這一特性使得納米材料能促進細(xì)菌聚集，使得細(xì)菌菌體之間保持穩(wěn)定的近距離接觸，從而有效促進ARGs在菌體之間的HGT。已有報道證實，納米Al2O3能吸附在游離菌體表面，縮短供體菌與受體菌間的空間距離以形成“接合橋”，從而促進耐藥質(zhì)粒RP4的接合轉(zhuǎn)移，而大顆粒Al2O3卻無類似效果[34]。但也有研究揭示，納米材料的吸附作用能夠抑制ARGs的HGT。Zou等[41]發(fā)現(xiàn)GO上不同的表面含氧基團可以有效地吸附DNA分子形成DNA-GO的復(fù)合物，同時GO還能插入到DNA的雙鏈中，影響質(zhì)粒上ARGs的生物特性并強烈抑制ARGs的復(fù)制，從而降低ARGs的豐度并控制ARGs的污染水平。進一步的研究顯示，GO納米片對于環(huán)狀質(zhì)粒ARGs的吸附去除效率要高于對線性基因組ARGs[42]，而遺傳分子的結(jié)構(gòu)差異可能是導(dǎo)致去除差異的原因。

納米材料除了對細(xì)菌有吸附作用，其較小的尺寸和形狀也會對細(xì)菌產(chǎn)生物理損傷。Ding等[35]研究發(fā)現(xiàn)，渦旋能使細(xì)菌細(xì)胞與納米Al2O3之間碰撞和相互作用的機率增加，并使細(xì)菌表面產(chǎn)生了更多的納米孔。這些納米孔可能是耐藥質(zhì)?；蚱渌鸇NA進入細(xì)胞質(zhì)的通道，進而促進ARGs的傳播。

圖2 納米材料對ARGs擴散的影響機制注：ROS表示活性氧。Fig. 2 Mechanisms of nanomaterials on ARGs diffusionNote: ROS stands for reactive oxygen species.

3.2 活性氧自由基

另外納米材料誘導(dǎo)的ROS還能調(diào)控細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，納米TiO2能通過ROS抑制RP4質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的負(fù)調(diào)控基因korA和korB的表達，從而促進DNA的轉(zhuǎn)移和復(fù)制[36]；納米Al2O3則能在顯著抑制3個負(fù)調(diào)控RP4接合轉(zhuǎn)移基因表達的同時，激活正調(diào)控RP4接合轉(zhuǎn)移的trfAp基因表達，進而促使RP4質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移與復(fù)制[34]。

4 總結(jié)與展望(Summary and prospect)

本文全面闡述了納米材料暴露對ARGs環(huán)境擴散的影響，以及納米材料本身的物理性質(zhì)和其誘發(fā)產(chǎn)生的ROS在ARGs水平轉(zhuǎn)移中的作用機制，從而拓展對ARGs的環(huán)境擴散過程的理解，并對納米材料非毒性環(huán)境效應(yīng)的評估提供理論支持。但目前納米材料對ARGs環(huán)境污染影響的研究中仍存在著一些不足并值得進一步深入探討的問題：

(1) 環(huán)境中ARGs發(fā)生HGT的方式有3種：接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前的研究只探究納米材料對接合和轉(zhuǎn)化這2種方式的影響，而對轉(zhuǎn)導(dǎo)擴散途徑的影響還未見報道。因此下一步的工作應(yīng)延伸至納米材料對噬菌體介導(dǎo)的ARGs轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究。

(2) 納米材料對ARGs擴散的影響，除了和材料自身的理化性質(zhì)有關(guān)外，還和其對微生物的生物效應(yīng)有重要關(guān)聯(lián)。目前的研究多集中于納米材料對ARGs擴散行為的研究，而忽視了轉(zhuǎn)化過程中生物調(diào)控機制的解析。因此，下一步的工作應(yīng)進一步探討微生物對納米材料響應(yīng)機制及其對ARGs擴散的影響。

(3) 實際環(huán)境條件很復(fù)雜，納米材料暴露于環(huán)境中，可能與其他環(huán)境物質(zhì)共同對ARGs傳播起作用。而目前的研究還僅限于納米材料自身對ARGs擴散的影響。因此，需要從納米材料的單因素影響拓展至復(fù)雜環(huán)境因素共同作用下的綜合影響。