苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽對(duì)皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)早期發(fā)育的毒性研究

多環(huán)芳烴(PAHs)作為化工溶劑廣泛應(yīng)用于化工行業(yè)中，是石油及其副產(chǎn)品的重要組成成分，近年來(lái)，由于工業(yè)活動(dòng)日益頻繁，導(dǎo)致水生生態(tài)系統(tǒng)中多環(huán)芳烴的含量日益增加[1]。隨著海洋石油運(yùn)輸、石油開發(fā)、海洋溢油和沿海石油化工業(yè)的快速發(fā)展，多環(huán)芳烴易進(jìn)入水體，進(jìn)而破壞海洋生態(tài)系統(tǒng)的平衡，威脅水生生物和人類的健康[2]。多環(huán)芳烴致畸、致癌和致突變的特性顯著[3]，生物毒性極強(qiáng)，由此引發(fā)的近岸海洋生態(tài)環(huán)境危害引起社會(huì)和學(xué)者廣泛關(guān)注。各國(guó)都將其列為水環(huán)境優(yōu)先控制的污染物之一[4]，我國(guó)的《室內(nèi)空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T 18883—2002)、《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB 8978—1996)、《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838—2002)都將其列為環(huán)境調(diào)查項(xiàng)目和污染參數(shù)。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于多環(huán)芳烴的研究主要集中在大氣、土壤、淡水和沉積物中，對(duì)于海洋中多環(huán)芳烴的研究主要集中在水生動(dòng)植物多環(huán)芳烴的檢測(cè)等方面，因此，在多環(huán)芳烴對(duì)水生生物生態(tài)毒性方面開展更深層次的探討，對(duì)研究多環(huán)芳烴對(duì)我國(guó)海洋環(huán)境危害方面具有重大意義[5-6]。

皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)，屬于原始腹足目，腹足綱。在我國(guó)鮑類養(yǎng)殖的總產(chǎn)量中占有主導(dǎo)地位，是我國(guó)北方海域一種重要的海洋養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)種類。作為海洋中的珍品，皺紋盤鮑肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，有多種醫(yī)用功效和抗癌作用，食用和藥用價(jià)值極高[7]。目前，關(guān)于皺紋盤鮑的研究集中在有害藻華對(duì)鮑的急性毒性影響[8]，溫度變化對(duì)鮑的生理活動(dòng)影響機(jī)制[9]，不同光照對(duì)皺紋盤鮑生長(zhǎng)和存活的影響[10]，分析鮑自身的免疫相關(guān)基因?qū)︴U死亡的影響，研究相關(guān)病害的治療和防護(hù)關(guān)系等方面[11]。本實(shí)驗(yàn)以皺紋盤鮑為研究對(duì)象，采用半靜水式實(shí)驗(yàn)方式，研究不同濃度苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽作用下皺紋盤鮑的卵子受精率、胚胎發(fā)育時(shí)間和幼體死亡率的差異。為探究皺紋盤鮑對(duì)多環(huán)芳烴污染的耐受能力，保護(hù)海洋生態(tài)環(huán)境和海洋養(yǎng)殖業(yè)以及科學(xué)制定多環(huán)芳烴的水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估多環(huán)芳烴對(duì)海洋環(huán)境和水生生物質(zhì)量安全的風(fēng)險(xiǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)皺紋盤鮑購(gòu)自大連海寶漁業(yè)有限公司，挑選健康的個(gè)體，殼長(zhǎng)8～9 cm，實(shí)驗(yàn)海水為大連黑石礁海域的砂濾海水，每24 h定時(shí)換水，投喂鮑魚體重30%的海帶，24 h持續(xù)微充氣。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中水體控制在水溫(20±1) ℃，鹽度30～31，pH 8.1～8.2，溶解氧保持在6 mg·L-1以上。從中挑選性腺飽滿的個(gè)體，進(jìn)行陰干、紫外線照射、海水刺激，獲得精子、卵子用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽，純度大于96%，購(gòu)自Sigma公司；丙酮(純度99.5%)、過(guò)氧化氫(體積分?jǐn)?shù)為30%)和三羥甲基氨基甲烷購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽用丙酮作助溶劑配制成高濃度的儲(chǔ)備液，實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)需要，向?qū)嶒?yàn)海水中添加不同體積的儲(chǔ)備液稀釋至實(shí)驗(yàn)所需的不同多環(huán)芳烴濃度。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 2種多環(huán)芳烴對(duì)鮑魚受精率的影響

受精率毒性實(shí)驗(yàn)在1 L玻璃燒杯中進(jìn)行，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，分別確定苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽的實(shí)驗(yàn)濃度范圍，設(shè)置為0.1、0.5、1、5、10和20 μg·L-1處理組，并設(shè)置空白對(duì)照組和丙酮助溶劑對(duì)照組，其中丙酮濃度為1‰，每組設(shè)置3個(gè)平行樣，實(shí)驗(yàn)條件與培養(yǎng)條件相同。卵子的密度約為50個(gè)·mL-1，精子密度約為50萬(wàn)個(gè)·mL-1，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的溶液共加入500 mL。持續(xù)攪拌均勻，鏡檢空白對(duì)照組的卵子受精率大于90%時(shí)，取樣觀察并計(jì)算各處理組的卵子的受精率。

1.2.2 2種多環(huán)芳烴對(duì)鮑魚胚胎幼體的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中水體控制在與培養(yǎng)條件相同的條件下，在胚胎生長(zhǎng)發(fā)育階段進(jìn)行避光培養(yǎng)，不曝氣，不投餌。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，分別確定苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽的實(shí)驗(yàn)濃度范圍，按等對(duì)數(shù)間距法設(shè)置4個(gè)質(zhì)量濃度梯度組，并設(shè)一個(gè)空白對(duì)照組和一個(gè)助溶劑對(duì)照組(丙酮)，每個(gè)處理組設(shè)立3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽濃度設(shè)置為0.1、0.5、1和5 μg·L-1，持續(xù)處理5 d，空白對(duì)照組胚胎發(fā)育至匍匐幼體期，取樣進(jìn)行鏡檢，記錄各處理組皺紋盤鮑從擔(dān)輪幼體期到匍匐幼體期的各個(gè)發(fā)育時(shí)期胚胎所需時(shí)間的差異。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，遵循相關(guān)的養(yǎng)殖以及毒性試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)，苯并[a]芘實(shí)驗(yàn)組濃度設(shè)置為1、5、10和20 μg·L-1；9,10-二甲基蒽實(shí)驗(yàn)組濃度設(shè)置為1、5、10和50 μg·L-1。各處理組持續(xù)處理12 d，3～12 d中每天下午3點(diǎn)對(duì)各處理組進(jìn)行檢查，記錄各處理組中鮑魚幼體的死亡數(shù)，計(jì)算幼體死亡率，及時(shí)清除死亡個(gè)體(死亡判定標(biāo)準(zhǔn)為在顯微鏡下觀察心跳停止為死亡[12])。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，求出死亡率和2種多環(huán)芳烴濃度對(duì)數(shù)的回歸方程，分別計(jì)算每組的LC10。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 19.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，分析處理組和對(duì)照組之間的差異，在數(shù)據(jù)處理中，采用T-test檢驗(yàn)，P<0.05、P<0.01時(shí)表示差異顯著，以“*”、“**”表示。

2 結(jié)果(results)

2.1 多環(huán)芳烴對(duì)種鮑受精的影響

苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽對(duì)皺紋盤鮑卵子受精率的影響結(jié)果如圖1和圖2所示，濃度為0.5、1、5、10和20 μg·L-1的苯并[a]芘處理組中受精率顯著下降(P<0.05)，其他處理組與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著差異變化；濃度為0.1、0.5、1、5、10和20 μg·L-1的9,10-二甲基蒽處理組與空白對(duì)照組相比受精率顯著下降(P<0.05)。這表明，苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽高濃度處理組對(duì)皺紋盤鮑卵子的受精有顯著抑制作用，濃度越高抑制作用越顯著，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。丙酮對(duì)照組與空白對(duì)照組的受精率無(wú)顯著變化(P=0.225>0.05)，表明丙酮助溶劑對(duì)照組可代替空白對(duì)照組。

圖1 不同濃度苯并[a]芘作用下皺紋盤鮑的受精率注： * P <0.05、** P <0.01表示與對(duì)照組相比，差異顯著；下同。Fig. 1 Fertilization rate of abalone under the treatment of benzo [a] pyrene at different concentrationsNote: * P <0.05, ** P <0.01 mean significant difference compared with the control; the same below.

圖2 不同濃度9,10-二甲基蒽作用下皺紋盤鮑的受精率Fig. 2 Fertilization rate of abalone under the treatment of 9,10-dimethylanthracene at different concentrations

2.2 多環(huán)芳烴對(duì)皺紋盤鮑胚胎發(fā)育的影響

多環(huán)芳烴對(duì)皺紋盤鮑胚胎的毒性作用主要表現(xiàn)為，胚胎發(fā)育時(shí)間延遲，胚胎的生長(zhǎng)受到抑制作用。如圖3和圖4所示，經(jīng)0.1、0.5、1和5 μg·L-1濃度的苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽處理后皺紋盤鮑的胚胎發(fā)育時(shí)間延長(zhǎng)。對(duì)比于空白對(duì)照組，0.1、0.5、1和5 μg·L-1的苯并[a]芘和0.5、1和5 μg·L-1的9,10-二甲基蒽組的皺紋盤鮑胚胎發(fā)育時(shí)間顯著增加(P<0.05)。并且隨著處理濃度的升高，皺紋盤鮑胚胎發(fā)育時(shí)間延長(zhǎng)，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖3 苯并[a]芘作用下皺紋盤鮑胚胎發(fā)育時(shí)間Fig. 3 Development time of abalone embryos under the treatment of benzo [a] pyrene

圖4 9,10-二甲基蒽作用下皺紋盤鮑胚胎的發(fā)育時(shí)間Fig. 4 Development time of abalone embryos under the treatment of 9,10-dimethylanthracene

2.3 2種多環(huán)芳烴對(duì)皺紋盤鮑幼體的慢性毒性

由圖5和圖6可知，不同濃度的苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽對(duì)皺紋盤鮑作用3～12 d后的死亡率。隨著苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽處理濃度的升高，皺紋盤鮑幼體死亡率升高，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。10、20 μg·L-1的苯并[a]芘處理組與對(duì)照組相比，死亡率在6 d之后達(dá)到最高(此時(shí)死亡率接近100%)，苯并[a]芘5 μg·L-1濃度組與對(duì)照組相比，死亡率在8 d之后達(dá)到最高(此時(shí)死亡率接近100%)。9,10-二甲基蒽各濃度組的死亡率明顯低于苯并[a]芘各濃度組。可推測(cè)苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽對(duì)皺紋盤鮑幼體的毒性影響存在差異，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行6 d后，苯并[a]芘的高濃度處理組大多數(shù)鮑魚幼體全部死亡，說(shuō)明苯并[a]芘對(duì)皺紋盤鮑的毒性作用高于9,10-二甲基蒽，長(zhǎng)時(shí)間作用下對(duì)皺紋盤鮑的影響更大。

丙酮對(duì)照組和空白對(duì)照組的T-test檢驗(yàn)參數(shù)P=0.3>0.05，可知丙酮對(duì)照組和空白對(duì)照組死亡率沒(méi)有顯著差異。與空白對(duì)照做T-test分析，1、5、10和20 μg·L-1的苯并[a]芘和1、5、10和50 μg·L-1的9,10-二甲基蒽處理組均表現(xiàn)為P<0.05，可知各組與空白對(duì)照組均有顯著差異。

圖5 不同濃度苯并[a]芘作用下皺紋盤鮑的死亡率Fig. 5 Mortality of abalone under the treatment of different concentrations of benzo [a] pyrene

圖6 不同濃度9,10-二甲基蒽作用下皺紋盤鮑的死亡率Fig. 6 Mortality of abalone under the treatment of different concentrations of 9,10-dimethylanthracene

2.4 2種多環(huán)芳烴對(duì)皺紋盤鮑幼體的LC10值

不同劑量的苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽對(duì)皺紋盤鮑幼體LC10結(jié)果詳見表1。苯并[a]芘對(duì)皺紋盤鮑幼體在1、5、10和20 μg·L-1時(shí)的LC10分別為11.6、8.18、7.67和7.66 mg·L-1；9,10-二甲基蒽對(duì)皺紋盤鮑幼體在1、5、10和50 μg·L-1時(shí)的LC10分別為14.91、14.11、12.82和9.64 mg·L-1。苯并[a]芘毒性大于9,10-二甲基蒽。

3 討論(Discussion)

海洋環(huán)境中多環(huán)芳烴有機(jī)污染物主要來(lái)源于海洋溢油事故和沿海石油化工業(yè)的廢水排放，對(duì)海洋生物生存和自然資源造成了嚴(yán)重破壞，已被列為我國(guó)環(huán)境優(yōu)先控制污染物名單[13-14]。根據(jù)原國(guó)家環(huán)保局1986制訂的《生物技術(shù)檢測(cè)規(guī)范(水環(huán)境部分)》標(biāo)準(zhǔn)(劇毒：LC50≤0.1 mg·L-1；高毒：0.1 mg·L-1﹤LC50≤1.0 mg·L-1；中毒：1.0 mg·L-1﹤LC50≤10.0 mg·L-1；低毒：LC50>10.0 mg·L-1)，苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽均具有致毒性，苯并[a]芘毒性較大。本實(shí)驗(yàn)研究表明，各處理組的皺紋盤鮑隨苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽處理組濃度的增加和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，卵子的受精率顯著降低，胚胎發(fā)育時(shí)間和幼體死亡率顯著增加，與處理濃度之間存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，多環(huán)芳烴濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)皺紋盤鮑的早期發(fā)育影響越大。在對(duì)于多環(huán)芳烴對(duì)條紋鋸鮨(Centropristisstriata)胚胎發(fā)育及早期仔魚的毒性研究中發(fā)現(xiàn)，隨著多環(huán)芳烴濃度的增加，受精卵的孵化率降低，畸形指數(shù)和仔魚死亡率增加，表現(xiàn)出的劑量-效應(yīng)關(guān)系，這與本研究的結(jié)果相一致[15]。通常對(duì)照組死亡率不應(yīng)該超過(guò)10%，但在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組幼體死亡率偏高，推測(cè)可能是因?yàn)榘櫦y盤鮑幼體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力較差，也有可能是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)過(guò)程中，皺紋盤鮑幼體對(duì)于海水中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生相互競(jìng)爭(zhēng)，亦或由于天氣原因或環(huán)境溫度過(guò)高等造成皺紋盤鮑死亡[16-17]。

我國(guó)有關(guān)多環(huán)芳烴對(duì)海洋鮑類的生殖毒性作用的研究表明，胚胎和幼體是海洋生物對(duì)環(huán)境污染物最為敏感的時(shí)期，關(guān)于胚胎和幼體的研究將更直觀地反映海洋受污染的現(xiàn)狀[18]，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇皺紋盤鮑的早期發(fā)育階段。前人研究發(fā)現(xiàn)，苯并[a]芘、菲和蒽對(duì)魚類胚胎不同發(fā)育階段的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)的損傷作用不同[19]；選取苯并[a]芘對(duì)雙齒圍沙蠶(Pernereisaibuhitensis)的3剛節(jié)疣足幼體進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)苯并[a]芘會(huì)引起蟲體的畸形，影響沙蠶幼體的發(fā)育[20]；苯使太平洋鯡魚(Clupeaharenguspallasi)胚胎和幼蟲胚胎組織生長(zhǎng)減緩，胚胎耗氧量增加，影響后期代謝作用[21]。高濃度的二甲苯導(dǎo)致斑馬魚(Brachydaniorerio)胚胎孵化率降低，胚胎死亡率升高，發(fā)育畸形，幼魚的運(yùn)動(dòng)速度減慢[22]。在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽對(duì)皺紋盤鮑幼體有毒性損傷作用，幼體甚至發(fā)生死亡。

表1 苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽對(duì)鮑魚幼體發(fā)育的回歸方程和LC10濃度Table 1 Regression equation and 10% lethal concentration of benzo [a] pyrene and 9,10-dimethylanthracene on the development of abalone larvae

注：r為相關(guān)系數(shù)；Y為死亡率；X為多環(huán)芳烴濃度對(duì)數(shù)。

Note:ris the correlation coefficient;Yis the mortality rate;Xis the logarithm of PAHs concentration.

本實(shí)驗(yàn)皺紋盤鮑胚胎和幼體在暴露于苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽后，隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)和暴露濃度的升高受精率顯著降低，胚胎發(fā)育時(shí)間和幼體死亡率顯著增加，存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。關(guān)于PAHs對(duì)皺紋盤鮑胚胎和幼體產(chǎn)生毒性作用的機(jī)理是否與魚類胚胎或者其他海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的致毒機(jī)理一致，有必要進(jìn)一步深入研究。