林建城，羅新明，林娟娟

1. 莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，莆田 351100 2. 福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(莆田學(xué)院)，莆田 351100

根據(jù)幾丁質(zhì)酶作用機(jī)理不同，現(xiàn)認(rèn)為至少包含有內(nèi)切幾丁質(zhì)酶、外切幾丁質(zhì)酶和具外切酶性質(zhì)的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52，NAGase)等3種組分[1]。近年來，NAGase在節(jié)肢動物中的生理作用被廣泛關(guān)注。Koga等[2]從家蠶(Bombyxmori)的表皮層中獲得NAGase，研究發(fā)現(xiàn)，蠶表皮NAGase與其周期性的蛻皮生理以及與生活周期中蛹的形成密切相關(guān)；隨后，Buchholz[3]研究了南極磷蝦(Euphausiasuperba)的蛻皮生理與NAGase活力變化的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在南極磷蝦蛻皮前短時間內(nèi)NAGase大量合成，酶活力迅速提高，用于降解蝦幾丁質(zhì)表皮；而Zou和Fingerman[4]的研究表明，招潮蟹(Ucapugilator)表皮和肝胰腺中NAGase的合成受類固醇蛻皮激素調(diào)控，NAGase活力變化與其周期性蛻皮之間存在密切相關(guān)。同樣，樸順金等[5]研究了不同養(yǎng)殖期凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)外殼膜NAGase的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)在蝦幼體和生殖期時，由于蛻殼頻繁，蝦外殼膜NAGase比活力會迅速升高，從而進(jìn)一步闡述了NAGase在節(jié)肢動物周期性蛻皮中的生理功能。

中國鱟(Tachypleustridentatus)屬于節(jié)肢動物門肢口綱劍尾目，已成為了瀕危物種，是國家二級保護(hù)動物，人類過度捕殺是導(dǎo)致其數(shù)量劇減的主要原因，另一個原因是工業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生的一些重金屬由于過量排放嚴(yán)重破壞了海水系統(tǒng)，鱟賴以生存的海域環(huán)境受到嚴(yán)重污染，擾亂了鱟的正常生理活動與物質(zhì)代謝。梁君榮等[6]的研究表明，Zn、Pb、Cu和Cd等重金屬對中國鱟的胚胎發(fā)育有不同的影響，當(dāng)這些重金屬離子的濃度超過漁業(yè)水域水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)濃度8倍時，Cd2+和Cu2+對鱟的胚胎發(fā)育無明顯影響，但Zn2+和Pb2+會使鱟胚胎發(fā)育中卵徑變小，發(fā)育速度下降，對鱟胚胎發(fā)育的毒性從大到小為Pb2+>Zn2+>Cu2+≈Cd2+。此后，研究發(fā)現(xiàn)，金屬離子對節(jié)肢動物特別是甲殼動物幾丁質(zhì)酶的生理生化有重要影響。張偉妮等[7]的研究表明，Ag+、Pb2+、Zn2+和Hg2+等4種重金屬離子對克氏原螯蝦(Procambarusclarkii) NAGase酶活力均有不同程度的可逆抑制作用，其中Ag+和Pb2+對酶還有先激活后抑制的作用；還有研究發(fā)現(xiàn)，Zn2+對鋸緣青蟹內(nèi)臟(Scyllaserrata)[8]NAGase會產(chǎn)生可逆抑制作用，Zn2+的存在會降低酶的溫度穩(wěn)定性；而Hg2+對凡鈉對蝦(Penaeusvannamei)[9]內(nèi)臟NAGase又有較強(qiáng)的不可逆的抑制作用。這說明環(huán)境中的金屬離子對節(jié)肢動物中與蛻皮生理相關(guān)的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生重要影響。在中國鱟的胚胎發(fā)育到性成熟期間，至少需經(jīng)19次蛻皮，鱟的蛻皮生理直接關(guān)系到鱟的正常生長與發(fā)育。Hg2+和Pb2+是環(huán)境中重金屬離子污染物的重要組成份，直接影響到水生動物的生理代謝并引起慢性毒性效應(yīng)[10-11]，但它們對中國鱟幾丁質(zhì)酶的影響，目前還未有深入研究。筆者課題組之前已對中國鱟內(nèi)臟NAGase進(jìn)行了分離純化[12]，現(xiàn)繼續(xù)探討Hg2+和Pb2+這2種重金屬離子對中國鱟NAGase的影響，研究中國鱟NAGase酶活力、構(gòu)象變化和效應(yīng)物之間的相關(guān)性，這對揭示海洋污染物與鱟蛻皮生理之間的相關(guān)性具有重要作用，并為能更好地保護(hù)鱟資源和合理開發(fā)利用鱟資源提供一些科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

參照文獻(xiàn)[12]所述方法分離純化中國鱟內(nèi)臟NAGase，分別通過抽提、30%和80%的飽和硫酸銨分級分離、Sephadex G-200凝膠層析以及DEAE-32離子交換層析分離，純化后獲得聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)單一純的酶制劑，比活力為505.21 U·mg-1，酶制劑在4 ℃下經(jīng)過雙蒸餾水透析后，用于Hg2+和Pb2+對NAGase影響的研究。

NAGase催化的底物對硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-β-D-GlcNAc)，分析純，由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院生化室合成；Sephadex G-200是Pharmacia產(chǎn)品；纖維素DEAE-32是Whatman產(chǎn)品；硝基酚(pNP)、HgCl2和Pb(NO3)2等試劑均為分析純，均為上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 中國鱟NAGase活力測定

按文獻(xiàn)[12]中NAGase活力的檢測方法測定中國鱟NAGase活力。在2 mL的酶活測定體系中，包含1 mL 75 mmol·L-1HAC-NaAC緩沖液(pH 5.4)，0.2 mL 5 mmol·L-1的底物pNP-β-D-GlcNAc，0.78 mL的雙蒸餾水，20 μL酶液。在37 ℃下反應(yīng)10 min，以2 mL 0.5 mol·L-1NaOH終止反應(yīng)，測定A405 nm，以先加2 mL 0.5 mol·L-1NaOH、后加20 μL酶液為空白對照。以產(chǎn)物硝基酚(pNP)為標(biāo)準(zhǔn)物，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。1個酶活力單位(U)定義為：在上述條件下，每分鐘催化水解產(chǎn)生1 μmol·L-1pNP所需的酶量規(guī)定為1 U，酶催化活力大小以酶促反應(yīng)速度(v)大小表示。

1.2.2 Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase活力的影響

在NAGase活力的測定體系中，在0～200 μmol·L-1范圍內(nèi)加入不同濃度的HgCl2，測定加入HgCl2后NAGase的剩余酶活力；以同樣的方法，在0～50 mmol·L-1范圍內(nèi)加入不同濃度的Pb(NO3)2，測定加入Pb(NO3)2后NAGase的剩余酶活力。以未添加金屬離子的對照組酶活力為100%，其他各試驗(yàn)組以相對酶活力(%)表示。

1.2.3 Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase的抑制作用機(jī)理

在2 mL NAGase活力的測定體系中，底物pNP-β-D-GlcNAc濃度為5 mmol·L-1，改變NAGase濃度(1.7、3.4、5.1、6.8和8.5 μg·mL-1)，分別測定在0、10、20、30和40 μmol·L-1等5種不同濃度HgCl2作用下NAGase的催化活力；同樣測定在0、15、20、25和30 mmol·L-1等5種不同濃度Pb(NO3)2作用下NAGase的催化活力，并設(shè)立各自對照組，以酶濃度對酶活力作圖，分別判斷Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase的抑制作用機(jī)理。

1.2.4 Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase的抑制作用類型

在NAGase活力的測定體系中，改變pNP-β-D-GlcNAc底物濃度(0.15、0.20、0.25、0.33和0.50 mmol·L-1)，分別測定在0、10、20、30和40 μmol·L-1等5種不同濃度HgCl2作用下NAGase的催化活力；同樣分別測定在0、15、20、25和30 mmol·L-1等5種不同濃度Pb(NO3)2作用下的NAGase催化活力。以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，確定中國鱟NAGase的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vm以及在HgCl2和Pb(NO3)2作用下的表觀米氏常數(shù)Kmapp和最大反應(yīng)速度Vmapp，分別判斷HgCl2和Pb(NO3)2對NAGase抑制作用的類型，并求解各自抑制常數(shù)KI。

1.2.5 Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase熒光發(fā)射光譜的影響

Hg2+對中國鱟NAGase熒光發(fā)射光譜影響的測定，采用的NAGase濃度為5.72 μg·mL-1，HgCl2濃度分別為0、10、20、30和40 μmol·L-1；而Pb2+對NAGase熒光發(fā)射光譜影響的測定，采用的NAGase濃度為8.59 μg·mL-1，Pb(NO3)2濃度分別為0、50、75、100、200、400和500 μmol·L-1，酶在2 mL 37.5 mmol·L-1HAC-NaAC緩沖液(pH 5.4)中分別與不同濃度的HgCl2和Pb(NO3)2混合，靜置30 min(37 ℃)，后用美國Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)掃描，在內(nèi)源熒光激發(fā)光譜波長為232.2 nm的條件下，測定NAGase的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜。

2 結(jié)果(Results)

2.1 Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase活力的影響

由圖1可知，Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase活性均有不同程度的抑制作用，抑制作用均呈濃度效應(yīng)，Hg2+比Pb2+對NAGase的抑制作用強(qiáng)，200 μmol·L-1Hg2+可抑制酶活力97.0%，而30 mmol·L-1Pb2+可使酶活力下降53.6%。這說明Hg2+和Pb2+這2種重金屬離子對中國鱟NAGase均有明顯抑制作用，Hg2+對NAGase的抑制作用強(qiáng)于Pb2+。

圖1 Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase活力的影響Fig. 1 Effects of Hg2+ and Pb2+ on the activity of NAGase from Tachypleus tridentatus

2.2 Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase的抑制作用機(jī)理

在5個不同酶濃度下，研究了Hg2+對中國鱟NAGase的影響效應(yīng)，結(jié)果如圖2所示，以NAGase催化反應(yīng)速度(v)對酶濃度作圖，得到一組通過原點(diǎn)的直線，隨Hg2+濃度逐漸升高，各直線斜率不斷降低，說明Hg2+對NAGase的抑制作用是屬于可逆抑制作用。同樣，研究了Pb2+對中國鱟NAGase的影響效應(yīng)，以加入Pb2+后NAGas催化反應(yīng)速度(v)對酶濃度作圖(圖3)，也得到一組通過原點(diǎn)的直線，隨Pb2+濃度升高，各直線的斜率也在降低，說明Pb2+對中國鱟NAGase的抑制作用也是一個可逆過程，屬于可逆抑制作用。結(jié)果表明，Hg2+和Pb2+都是通過抑制NAGase活力而降低酶的催化效率，不是通過降低反應(yīng)體系中的有效酶量而使酶活力降低的[13]。

圖2 Hg2+對中國鱟NAGase抑制機(jī)理的判斷注：v為酶促反應(yīng)速度；直線0～4，Hg2+濃度分別為0、10、20、30和40 μmol·L-1。Fig. 2 Determination of the inhibitory mechanism of Hg2+ on NAGase from Tachypleus tridentatusNote: v is the rate of reaction; Concentrations of Hg2+ for curves 0～4 were 0, 10, 20, 30 and 40 μmol·L-1, respectively.

圖3 Pb2+對中國鱟NAGase抑制機(jī)理的判斷注：直線0～4，Pb2+濃度分別為0、15、20、25和30 mmol·L-1。Fig. 3 Determination of the inhibitory mechanism of Pb2+ on NAGase from Tachypleus tridentatus Note: Concentrations of Pb2+ for curves 0～4 were 0, 15, 20, 25 and 30 mmol·L-1, respectively.

2.3 Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase的抑制作用類型

通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖判斷Hg2+對中國鱟NAGase的抑制類型，結(jié)果(圖4a)表明，隨著Hg2+濃度增大，相應(yīng)的5條直線的斜率也逐漸增大，這5條直線交于y軸上的一點(diǎn)，Hg2+對酶的抑制并不改變酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速度(Vm)，Kmapp值隨著Hg2+濃度的增大而增大，說明Hg2+對NAGase的抑制是屬于競爭性抑制作用。Hg2+與底物之間競爭地與NAGase活性中心結(jié)合，從而影響了NAGase與底物的親和力，Hg2+只與游離酶(E)結(jié)合，而不與酶-底物絡(luò)合物(ES)結(jié)合。以圖4a各直線斜率對相應(yīng)的Hg2+濃度作圖(圖4b)，得到一條直線，直線方程為y=1.323×10-3x+0.030，從直線方程可以求得Hg2+對中國鱟NAGase的抑制常數(shù)KI為22.68 μmol·L-1。

同樣，研究了Pb2+對中國鱟NAGase的抑制類型，Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖(圖5a)，結(jié)果顯示，5條直線在第二象限相交于一點(diǎn)，各直線在橫軸的截距和在縱軸的截距都隨Pb2+濃度的變化而變化，隨著Pb2+濃度的增大，NAGase相應(yīng)的Kmapp值增大，而相應(yīng)的Vmapp值下降。以圖5a各直線斜率對Pb2+濃度進(jìn)行二次作圖(圖5b)，得到一直線，直線方程為y=1.516×10-3x+0.029，求出Pb2+對酶的抑制常數(shù)(KI)為19.13 mmol·L-1，即競爭性抑制常數(shù)；再以圖5a各直線在縱軸的截距對Pb2+濃度作圖(圖5c)，得到一直線，直線方程為y=0.997×10-3x+0.075，求出Pb2+對ES的抑制常數(shù)(KIS)為75.23 mmol·L-1，即非競爭性抑制常數(shù)KIS為75.23 mmol·L-1，KI

圖4 Hg2+對中國鱟腸道NAGase抑制作用的Lineweaver-Burk關(guān)系圖注：直線0～4，Hg2+濃度分別為0、10、20、30和40 μmol·L-1。Fig. 4 Lineweaver-Burk plots for inhibitory effect of Hg2+ on the activity of NAGase from Tachypleus tridentatus Note: Concentrations of Hg2+ for curves 0～4 were 0, 10, 20, 30 and 40 μmol·L-1, respectively.

圖5 Pb2+對中國鱟腸道NAGase抑制作用的Lineweaver-Burk關(guān)系圖注：直線0～4，Pb2+濃度分別為0、15、20、25和30 mmol·L-1。Fig. 5 Lineweaver-Burk plots for inhibitory effect of Pb2+ on the activity of NAGase from Tachypleus tridentatusNote: Concentrations of Pb2+ for curves 0～4 were 0, 15, 20, 25 and 30 mmol·L-1, respectively.

2.4 Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase內(nèi)源熒光發(fā)射光譜的影響

目前，研究蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象的主要方法包括紫外吸收光譜、熒光光譜、圓二色譜和核磁共振等[13]。本研究是通過測定酶的熒光光譜變化來判斷酶蛋白的空間構(gòu)象的變化。由圖6可知，天然酶NAGase的熒光發(fā)射峰在332 nm處，加入效應(yīng)物Hg2+后，酶蛋白的熒光強(qiáng)度發(fā)生了變化，隨著Hg2+濃度增大，酶的熒光強(qiáng)度逐漸下降，但酶的熒光發(fā)射峰沒有位移，熒光發(fā)射峰的波長基本不變。酶的熒光強(qiáng)度發(fā)生變化表明了相應(yīng)的酶蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生了變化，說明Hg2+對中國鱟NAGase的抑制作用是通過改變酶的空間構(gòu)象所致。

進(jìn)一步研究了Pb2+對中國鱟NAGase內(nèi)源熒光發(fā)射光譜的影響，由圖7可知，因?yàn)樵囼?yàn)采用的酶濃度與Hg2+試驗(yàn)組不同，獲得的熒光發(fā)射強(qiáng)度也有差異。結(jié)果表明，隨著效應(yīng)物Pb2+濃度增大，NAGase的熒光強(qiáng)度逐漸下降，當(dāng)Pb2+濃度為500 μmol·L-1時酶的熒光消失，但酶的熒光發(fā)射峰始終沒有產(chǎn)生位移。這說明Pb2+與中國鱟NAGase分子的結(jié)合致使酶蛋白空間構(gòu)象產(chǎn)生變化，酶活力下降，酶熒光發(fā)射強(qiáng)度隨之改變。

圖6 中國鱟NAGase在HgCl2中的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜注：曲線0～4，Hg2+濃度分別為0、10、20、30和40 μmol·L-1。Fig. 6 Fluorescence emission spectra of NAGase from Tachypleus tridentatus in HgCl2 solutionNote: Concentrations of 0, 10, 20, 30 and 40 μmol·L-1 for curves 0～4, respectively.

圖7 中國鱟NAGase在Pb(NO3)2中的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜注：曲線0～6，Pb(NO3)2濃度分別為0、50、75、100、200、400和500 μmol·L-1。Fig. 7 Fluorescence emission spectra of NAGase from Tachypleus tridentatus in Pb(NO3)2 solutionNote: Concentrations of 0, 50, 75, 100, 200, 400 and 500 μmol·L-1 for curves 0～6, respectively.

3 討論(Discussion)

重金屬離子對酶經(jīng)常呈現(xiàn)抑制現(xiàn)象，但不同重金屬離子對NAGase的抑制機(jī)理和抑制類型不同。楊學(xué)敏等[14]的研究表明：Fe3+和Cd2+對鋸緣青蟹內(nèi)臟NAGase的抑制均呈競爭性-反競爭性混合Ⅱ型效應(yīng)。而Zn2+對鋸緣青蟹NAGase則呈現(xiàn)可逆的混合型抑制作用，結(jié)果顯示，Zn2+與游離酶(E)的親和力比Zn2+與酶-底物絡(luò)合物(ES)的親和力強(qiáng)，在Zn2+作用下NAGase的熒光發(fā)射強(qiáng)度降低，說明Zn2+是通過改變酶蛋白空間構(gòu)象變化致使酶活力下降[8]；但ZnSO4對尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[15]精巢NAGase表現(xiàn)為競爭性的抑制作用。王君等[16]的研究表明，Cu2+對棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)蛹NAGase的抑制作用是一種可逆的混合型抑制；而CuSO4對尼羅羅非魚精巢NAGase的抑制則為非競爭性抑制作用[15]，同時，在CuSO4作用下酶的熒光發(fā)射峰值呈降低現(xiàn)象。此外，Ag+對克氏原螯蝦內(nèi)臟NAGase的抑制作用又表現(xiàn)為反競爭性抑制[7]；而鎘離子對尼羅羅非魚精巢NAGase的抑制為競爭性抑制作用[17]。

Hg2+對酶往往有較強(qiáng)的抑制作用，其對不同性質(zhì)的酶或?qū)Σ煌瑏碓吹拿缸饔脵C(jī)理同樣存在差異。蔡西玲等[18]研究了Hg2+對木瓜蛋白酶的抑制機(jī)理，結(jié)果表明，當(dāng)CHg2+≤10-6mol·L-1時，對酶表現(xiàn)為非競爭性不可逆激活作用，但當(dāng)CHg2+≥10-4mol·L-1時，對酶的抑制作用呈現(xiàn)以競爭性抑制為主，Hg2+可與酪蛋白競爭性地與木瓜蛋白酶的活性中心結(jié)合，導(dǎo)致對酶的抑制，同時Hg2+結(jié)合后木瓜蛋白酶的熒光猝滅，熒光發(fā)射峰發(fā)生紅移，表明Hg2+與酶蛋白之間存在相互作用，發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移，Hg2+可能導(dǎo)致木瓜蛋白酶分子的微環(huán)境疏水性有所降低，從而引起酶活力的下降。而耿芳宋等[19]的研究表明，Hg2+是人胎盤耐熱性堿性磷酸酶的混合性抑制劑，并使酶的構(gòu)象發(fā)生改變，當(dāng)CHgCl2>1.00 mmol·L-1時，熒光強(qiáng)度不斷下降，但峰位不變。此外，Hg2+對鋸緣青蟹內(nèi)臟NAGase的抑制表現(xiàn)為可逆的競爭性抑制作用[20]，但對尼羅羅非魚精巢NAGase又表現(xiàn)為不可逆抑制作用[21]。已有研究還發(fā)現(xiàn)，Hg2+對凡納對蝦內(nèi)臟NAGase的不可逆抑制作用，可能是Hg2+與酶蛋白的巰基結(jié)合從而引起酶的空間結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致酶失活，而且底物還具有保護(hù)Hg2+所引起的酶失活作用[9]。本研究結(jié)果表明，Hg2+對中國鱟NAGase抑制作用表現(xiàn)為可逆的競爭性抑制，在Hg2+作用下NAGase熒光強(qiáng)度降低，但酶的內(nèi)源熒光發(fā)射峰沒有位移，說明Hg2+對NAGase催化活力的抑制是酶的空間構(gòu)象發(fā)生變化所致，Hg2+可能也是與中國鱟NAGase酶蛋白的巰基產(chǎn)生鰲合作用而引起空間構(gòu)象的變化。

Pb2+對酶的抑制機(jī)理目前研究的還不多。有研究表明，Pb(NO3)2是人胎盤耐熱性堿性磷酸酶的反競爭性抑制劑，在不同濃度Pb(NO3)2的作用下，堿性磷酸酶的熒光強(qiáng)度和發(fā)射峰位均發(fā)生了變化，當(dāng)Pb(NO3)2濃度為10.0 mmol·L-1時，酶活力喪失，熒光猝滅[19]；而Pb2+對克氏原螯蝦內(nèi)臟NAGase的抑制又表現(xiàn)為非競爭性抑制[7]。從本研究結(jié)果可知，Pb2+對中國鱟內(nèi)臟NAGase的抑制是一個可逆的過程，屬于競爭性-非競爭性混合型抑制作用，比較了抑制常數(shù)KIS和KI值大小，發(fā)現(xiàn)Pb2+在游離酶和絡(luò)合物之間，更易于與游離酶結(jié)合而引起對酶的抑制作用。Pb2+可使得中國鱟NAGase的內(nèi)源熒光發(fā)射強(qiáng)度改變，但沒有產(chǎn)生峰值移位現(xiàn)象，當(dāng)Pb(NO3)2濃度是0.5 mmol·L-1時，NAGase的內(nèi)源熒光猝滅(圖7)，而這時酶活力才剛開始下降(圖1)，這種現(xiàn)象說明了Pb2+使酶蛋白空間構(gòu)象發(fā)生變化要快于造成的酶活力的變化，維系酶空間構(gòu)象穩(wěn)定的必需基團(tuán)對Pb2+相當(dāng)敏感，這與張偉妮等[15]研究的CuSO4對尼羅羅非魚精巢NAGase活力和構(gòu)象的影響結(jié)果相似；但Zhang等[8]在Zn2+對鋸緣青蟹NAGase抑制動力學(xué)的研究中，發(fā)現(xiàn)Zn2+作用后NAGase活力的變化快于酶空間構(gòu)象的變化。同時，進(jìn)一步推測Pb2+可能是與NAGase的必需基團(tuán)巰基形成鰲合物，或可能是與酶活性中心的羧基結(jié)合，從而導(dǎo)致酶蛋白空間構(gòu)象變化[19]。

綜上所述：Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase的抑制作用均表現(xiàn)為可逆過程，其中Hg2+對NAGase的抑制屬于競爭性抑制作用，Hg2+只與游離酶結(jié)合，不與酶-底物絡(luò)合物結(jié)合；而Pb2+對NAGase的抑制是屬于競爭性-非競爭性混合型抑制作用，相比于酶-底物絡(luò)合物，Pb2+對游離酶的親和力更強(qiáng)。Hg2+和Pb2+對中國鱟NAGase的抑制作用都是酶蛋白空間構(gòu)象的變化所致。而Hg2+和Pb2+與NAGase酶蛋白功能基團(tuán)之間的互作機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

致謝：感謝莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院林授鍇博士和汪秀妹博士在英文摘要寫作上給予的幫助。