新型溴代阻燃劑TBB和TBPH混合物對羅非魚甲狀腺激素和生理生化指標(biāo)的影響

郭震，陶永剛，陳棉彪，黃楚珊，張麗娟，胡國成,*

1. 錦州醫(yī)科大學(xué)，錦州 121001 2. 生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學(xué)研究所，廣州 510535 3. 國家環(huán)境保護(hù)環(huán)境污染健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510535

自從1908年G.A. Engelard等用天然橡膠與氯氣反應(yīng)合成阻燃氯化橡膠以來，阻燃劑技術(shù)獲得了迅猛發(fā)展，國際市場上開發(fā)出許多新型、高效的阻燃劑[1]。目前，至少有75種溴代阻燃劑(BFRs)在市場上進(jìn)行了商品化，由于這些外源性污染物具有持久性、蓄積性、生物毒性及“三致效應(yīng)”，無意釋放到環(huán)境會對人類健康造成潛在威脅[2-3]。FM550是美國科聚亞公司2003年生產(chǎn)的添加型溴代阻燃劑，廣泛應(yīng)用于聚氨酯泡沫、兒童用品及汽車飾品中[4]。FM550成分比較復(fù)雜，主要包括2-乙基己基-四溴苯甲酸(TBB)、2,3,4,5-四溴-苯二羧酸雙(2-乙基己基)酯(TBPH)、磷酸三苯酯(TPP)及其類似物(iTPP)[5]。TBB能在生物體內(nèi)代謝為四溴苯甲酸(TBBA)[6]；TBPH在光的作用下可降解為一種增塑劑——鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)，能干擾機(jī)體脂肪酸代謝及甲狀腺激素水平，對生態(tài)環(huán)境和人體健康產(chǎn)生潛在風(fēng)險(xiǎn)[7]。

FM550作為PBDEs的主要替代品，主要添加到家具、兒童用品及汽車飾品中[8]。有研究資料顯示，TBB和TBPH在地表水、環(huán)境空氣、土壤和室內(nèi)積塵等環(huán)境介質(zhì)中均有不同程度的檢出[9-11]；在水生生物、海洋哺乳動(dòng)物體內(nèi)也有積累富集[12]。此外，F(xiàn)M550還可以通過大氣傳輸進(jìn)行長距離遷移[13]。

本研究利用傳統(tǒng)毒理學(xué)研究方法，以羅非魚作為實(shí)驗(yàn)對象，通過飼料添加不同濃度的FM550進(jìn)行口服攝入染毒。由于FM550在國內(nèi)較難購買，本研究參照Patisaul等[14]和Saunders等[15]的實(shí)驗(yàn)方法，將TBB和TBPH的1∶1混合物用于替代FM550。筆者深入研究了FM550暴露對魚類甲狀腺激素以及血清生理生化指標(biāo)的影響，為新型溴代阻燃劑FM550的使用提供毒理學(xué)資料，為FM550環(huán)境管理及控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試生物

實(shí)驗(yàn)用尼羅羅非魚購于廣東省羅非魚良種場。將羅非魚飼養(yǎng)于羅非魚養(yǎng)殖系統(tǒng)，每日投喂飼料3次，飼養(yǎng)水溫控制在(25±1) ℃，光暗比為14 h：10 h。飼養(yǎng)一周后選取體型相近、健康活潑的個(gè)體供試。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

2-乙基己基-四溴苯甲酸(TBB)純度為99%，2,3,4,5-四溴-苯二羧酸雙(2-乙基己基)酯(TBPH)純度為99%，均購于百靈威試劑公司。

1.3 儀器設(shè)備

全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(CENTAURXP，美國西門子公司)；全自動(dòng)生化分析儀(Cobas702，瑞士羅氏公司)；血細(xì)胞分析儀(XE5000，日本希森美康公司)；電子分析天平(0.1 mg/0.01 mg，MU105DU，瑞士梅特勒托利多公司)；低溫冷凍離心機(jī)(Sorvall Stratos，美國賽默飛世爾科技公司)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 暴露實(shí)驗(yàn)

將飼料原料粉碎后，過80目標(biāo)準(zhǔn)篩，然后按所需量稱重后混勻，在此過程中，分別按照0、10、100和400 ng·g-1的添加量加入TBB和TBPH的1∶1混合物的丙酮溶液。暴露實(shí)驗(yàn)在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行，將前期選擇的480尾羅非魚進(jìn)行分組養(yǎng)殖，分成1個(gè)對照組以及低、中、高3個(gè)暴露組，每組4個(gè)平行，每個(gè)平行30尾魚。實(shí)驗(yàn)期間每天均測定養(yǎng)殖水的基本參數(shù)以保證羅非魚有一定適宜程度的生長環(huán)境，經(jīng)每天測定實(shí)驗(yàn)期間水溫，基本維持在25 ℃左右，明暗控制為14 h 光：10 h 暗。養(yǎng)殖期間，每天在10:00、14:00和18:00分3次進(jìn)行投喂，每日的投喂量為魚體重的8%，在每次喂食0.5 h后，用虹吸管將養(yǎng)殖缸底部飼料殘?jiān)凹S便吸出，暴露期為56 d。

1.4.2 樣品采集

暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)平行選取3尾羅非魚，測量每尾魚的體重、體長和體高。使用1 mL的一次性無菌注射器對羅非魚進(jìn)行尾靜脈取血，靜置4 h后，用離心機(jī)以4 000 r·min-1的速度離心15 min，將上層血清吸出后，轉(zhuǎn)移到-80 ℃的冰箱中保存，用于甲狀腺激素以及血清生理生化指標(biāo)的測定。此外，使用抗凝取血管取全血，進(jìn)行全血生理生化指標(biāo)的測定。

1.4.3 指標(biāo)的測定

血清中的甲狀腺激素使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行測定，使用的方法為化學(xué)發(fā)光法，主要的測定指標(biāo)為三碘甲狀腺原氨酸(T3)、四碘甲狀腺原氨酸(T4)、游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離四碘甲狀腺原氨酸(FT4)和促甲狀腺激素(TSH)。血清中的生理生化指標(biāo)使用羅氏全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測定，測定的指標(biāo)為谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷草轉(zhuǎn)氨酶/谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST/ALT)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)。全血的生理生化指標(biāo)使用血細(xì)胞分析儀進(jìn)行測定，主要指標(biāo)為白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白測定(Hb)和血小板計(jì)數(shù)(PLT)。以上指標(biāo)的測定均嚴(yán)格按照儀器操作規(guī)程操作，并按照試劑說明書設(shè)置參數(shù)。檢測前進(jìn)行常規(guī)校準(zhǔn)，并確定高、中、低3種室內(nèi)質(zhì)控水平全部在控。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±se)來表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用Dunnett’s t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，當(dāng)P<0.05時(shí)表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析(Resuls and analysis)

2.1 FM550對羅非魚生長指標(biāo)的影響

羅非魚的初始體重、體長如表1所示，各暴露組在暴露之前體重、體長差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 羅非魚的初始生長數(shù)據(jù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Table 1 The initial growth data of tilapia

含不同濃度的FM550飼料飼喂56 d后，羅非魚的基本生長指標(biāo)(體重、飼料系數(shù)、肝體比、脂體比、肥滿度和存活率)的變化如圖1所示。在羅非魚暴露于不同濃度FM550 56 d后，各暴露組與對照組差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這說明不同濃度的FM550暴露在56 d內(nèi)對羅非魚的基本生長指標(biāo)影響不大。

圖1 FM550對基本生長指標(biāo)的影響Fig. 1 Effects of FM550 on basic growth index of tilapia

2.2 FM550對羅非魚血清中甲狀腺激素的影響

2.2.1 FM550對羅非魚血清中T3和T4含量的影響

不同濃度的FM550飼料暴露對羅非魚血清中T3和T4含量的影響如圖2所示，羅非魚暴露于不同濃度FM550 56 d后，隨著暴露濃度的增加，羅非魚血清中T3含量逐漸降低，T4含量先降低后升高。相對于對照組，高濃度暴露組血清中T3含量顯著降低(P<0.05)，T4含量升高，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低、中濃度暴露組血清中T3、T4含量均降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，T4含量與對照組相差不大(P>0.05)。高濃度FM550暴露對T3抑制率最高達(dá)到了45.96%，對T4的促進(jìn)率最高達(dá)到了20.91%。

圖2 FM550對血清中三碘甲狀腺原氨酸(T3)和四碘甲狀腺原氨酸(T4)含量的影響注：“*”表示實(shí)驗(yàn)組與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 2 Effects of FM550 on the contents of triiodothyronine (T3) and tetraiodothyronine iodine (T4) in serumNote: “*” indicates significant difference between the treatment and the control (P<0.05).

2.2.2 FM550對羅非魚血清中FT3和FT4含量的影響

不同濃度的FM550飼料暴露對羅非魚血清中FT3和FT4含量的影響如圖3所示，羅非魚暴露于不同濃度FM550 56 d后，隨著暴露濃度的增加，羅非魚血清中FT3含量逐漸降低，F(xiàn)T4含量先降低后升高。相對于對照組，高濃度暴露組血清中FT3含量顯著降低(P<0.05)，低、中濃度暴露組FT3含量降低，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。相對于對照組，高濃度暴露組的FT4含量升高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低、中濃度暴露組血清中FT3、FT4含量均降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。相對于對照組，高濃度組FM550暴露對FT3抑制率最高達(dá)到了30.03%，對FT4的促進(jìn)率最高達(dá)到了77.98%。

圖3 FM550對血清中的游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)和游離四碘甲狀腺原氨酸(FT4)的含量影響注：“*”表示實(shí)驗(yàn)組與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 3 Effects of FM550 on the contents of free triiodothyronine (FT3) and free tetraiodothyronine (FT4) in serumNote: “*”indicates significant difference between the treatment and the control (P<0.05).

2.2.3 FM550對羅非魚血清中TSH含量的影響

不同濃度的FM550飼料暴露對羅非魚血清中TSH含量的影響如圖4所示，羅非魚暴露于不同濃度FM550 56 d后，隨著暴露濃度的增加，羅非魚血清中的TSH含量并無明顯變化。

圖4 FM550對血清中的促甲狀腺激素(TSH)的含量影響Fig. 4 Effects of FM550 on the contents of thyroid stimulating hormone (TSH) in serum

2.3 FM550對羅非魚血清中生理生化指標(biāo)的影響

2.3.1 FM550對羅非魚血清中AST和ALT含量的影響

不同濃度的FM550飼料暴露對羅非魚血清中AST和ALT含量的影響如圖5所示，羅非魚暴露于不同濃度FM550 56 d后，隨著暴露濃度的增加，血清中的ALT含量值并無顯著性變化(P>0.05)，說明FM550的暴露對羅非魚的ALT含量影響不大。羅非魚暴露于FM550 56 d后，隨著暴露濃度的增加，血清中的AST含量值并無顯著性變化(P>0.05)，說明FM550暴露對羅非魚的AST含量影響不大。

圖5 FM550對血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的含量影響Fig. 5 Effects of FM550 on the contents of aspartate transaminase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) in serum

2.3.2 FM550對羅非魚血清中TC、TG含量的影響

不同濃度的FM550飼料暴露對羅非魚血清中TC和TG含量的影響如圖6所示，羅非魚暴露于FM550 56 d后，各處理組的TC、TG均值低于對照組，而且均有顯著性差異(P<0.05)，而且高劑量組的TC、TG含量均為最低，相對于對照組，高濃度暴露組對TC的抑制率達(dá)到了80.7%，對于TG的抑制率達(dá)到了28.8%。

圖6 FM550對血清中的總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含量影響注：“*”表示實(shí)驗(yàn)組與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 6 Effects of FM550 on the contents of total cholesterol (TC) and triglyceride (TG) in serumNote: “*” indicates significant difference between the treatment and the control (P<0.05).

2.3.3 FM550對羅非魚血清中HDL-C、LDL-C含量的影響

不同濃度FM550飼料暴露對羅非魚血清中HDL-C和LDL-C含量的影響如圖7所示，羅非魚暴露于不同濃度FM550 56 d后，與對照組相比，高濃度組的HDL-C值升高，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而中、低濃度的HDL-C值與對照組相比并無顯著性差異(P>0.05)。這說明高濃度的FM550暴露會導(dǎo)致魚HDL-C含量的升高。羅非魚暴露于不同濃度FM550 56 d后，與對照組相比，高濃度的FM550暴露會導(dǎo)致魚LDL-C的含量降低，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這說明高濃度的FM550暴露會導(dǎo)致魚LDL-C含量的降低。

圖7 FM550對血清中的高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)的含量影響注：“*”表示實(shí)驗(yàn)組與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 7 Effects of FM550 on the contents of high density lipoprotein (HDL-C) and low density lipoprotein (LDL-C) in serumNote: “*” indicates significant difference between the treatment and the control (P<0.05).

2.4 FM550對魚全血生理生化指標(biāo)的影響

FM550對魚全血的生理生化指標(biāo)影響如表2所示，羅非魚暴露于FM550 56 d后，各暴露組與對照組相比，各項(xiàng)指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這說明FM550的暴露并不會導(dǎo)致魚全血生理生化指標(biāo)的變化。

3 討論(Discussion)

魚類的生長指標(biāo)是反映魚類生長狀況的基礎(chǔ)指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過56 d的不同濃度FM550暴露后，各組間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重、飼料系數(shù)、肥滿度、脂體比、臟體比以及存活率均未產(chǎn)生顯著性差異，說明在56 d的暴露期內(nèi)，不同濃度FM550的暴露對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基本生長狀況影響不大。

甲狀腺是動(dòng)物體內(nèi)的重要腺體，主要依靠T3和T4來調(diào)節(jié)生物體作用[16]，其中T3是甲狀腺激素的主要活動(dòng)形式，T3進(jìn)入細(xì)胞后與細(xì)胞核內(nèi)的甲狀腺受體結(jié)合，作用于轉(zhuǎn)錄過程，實(shí)現(xiàn)其對靶基因的正性/負(fù)性調(diào)控，以調(diào)節(jié)機(jī)體的生長發(fā)育和代謝平衡[17]，但T3與T4并不具有生物活性，要通過轉(zhuǎn)化形成FT3和FT4后才能進(jìn)入細(xì)胞[15]。一些實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)M550可以擾亂甲狀腺素在機(jī)體內(nèi)的穩(wěn)定狀態(tài)[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對于羅非魚進(jìn)行FM550的高濃度暴露可導(dǎo)致羅非魚血清內(nèi)的T3含量降低，T4水平升高?？梢酝普揊M550會對羅非魚甲狀腺激素的分泌與合成產(chǎn)生促進(jìn)作用，并且可以抑制T4向T3轉(zhuǎn)化。隨著FM550的暴露濃度的增加，羅非魚游離甲狀腺激素FT3含量呈降低趨勢，F(xiàn)T4的含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。Patisaul等[14]研究發(fā)現(xiàn)，將大鼠暴露于FM550后，大鼠血清中的T4水平升高且T3水平不變。McGee等[19]研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚暴露于FM550后，斑馬魚血清中的T4和T3水平均升高，F(xiàn)T3含量升高，F(xiàn)T4含量降低。以上研究結(jié)果表明，F(xiàn)M550會對甲狀腺激素產(chǎn)生一定的干擾作用，但以上結(jié)果與本研究有一定差異，這可能與暴露時(shí)間、暴露劑量以及研究對象的代謝轉(zhuǎn)化效果不同有關(guān)。但這些研究結(jié)果均驗(yàn)證了FM550的暴露會影響甲狀腺激素的內(nèi)穩(wěn)態(tài)水平。不過，目前FM550對甲狀腺作用的具體機(jī)制還不是很明確，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來論證。

表2 FM550對全血生理生化指標(biāo)含量的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Table 2 Effects of FM550 on the contents of physiological indexes and biochemical indicators in the blood

注：WBC表示白細(xì)胞計(jì)數(shù)，RBC表示紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，Hb表示血紅蛋白，Plt表示血小板計(jì)數(shù)。

Note: WBC means white blood cell; RBC means red blood cell; Hb means hemoglobin; Plt means blood platelet.

ALT和AST是機(jī)體內(nèi)2種十分重要的轉(zhuǎn)氨酶，主要存在于機(jī)體的細(xì)胞核及線粒體中，平時(shí)一般在血清中含量極低[20]。只有在肝臟細(xì)胞受到損傷后，才會大量釋放入血，引起血清中ALT及AST的含量升高，因此，一般將ALT和AST在血清內(nèi)的含量作為肝臟受到損傷的敏感指標(biāo)[21]。而在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，各暴露組的AST、ALT水平與對照組相比并無顯著性差異，說明FM550對肝臟并無明顯損傷作用。羅非魚血清中的TC、TG、HDL-C和LDL-C水平可以反映出羅非魚的脂代謝水平，在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對羅非魚進(jìn)行FM550的高劑量暴露會導(dǎo)致羅非魚血清TC、TG含量降低，HDL-C含量升高，LDL-C的含量降低，結(jié)合羅非魚的基本生長數(shù)據(jù)并無明顯差異的情況，可推論由于在FM550暴露時(shí)，羅非魚耗能增多，導(dǎo)致羅非魚脂肪消耗增多。但FM550對于羅非魚脂代謝改變的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來論證。

雖然，動(dòng)物的全血指標(biāo)會受生理狀態(tài)、測定方法和生活環(huán)境等諸多外界因素的影響，但是全血指標(biāo)還是一種能客觀反映動(dòng)物機(jī)體的生理機(jī)能及代謝狀況的重要指標(biāo)，如有波動(dòng)，則提示機(jī)體可能產(chǎn)生生理或病理變化[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)M550的暴露并未對羅非魚的全血指標(biāo)產(chǎn)生特異性改變，說明FM550的暴露對羅非魚的生理機(jī)能影響不大。

根據(jù)以上內(nèi)容，可得出如下結(jié)論，在不同劑量的FM550暴露的56 d期間，各組間羅非魚的基礎(chǔ)生長數(shù)據(jù)并無顯著差異，但FM550的暴露可以改變羅非魚的甲狀腺激素水平，具體表現(xiàn)為高劑量的FM550暴露可以使羅非魚血清中的T3、FT3含量降低，T4、FT4含量升高，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。同時(shí)，F(xiàn)M550的暴露還可以導(dǎo)致羅非魚的脂代謝改變，具體變化為導(dǎo)致血清中TC、TG含量降低，HDL-C含量升高，LDL-C含量降低。此外，不同劑量的FM550暴露對羅非魚的全血生化指標(biāo)并無影響。

致謝：感謝華南農(nóng)業(yè)大學(xué)甘煉副教授在暴露實(shí)驗(yàn)中給予的幫助。